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L'obiettivo generale di questa procedura è quello di confinare le reazioni di sintesi proteica libera in volumi cellulari rilevanti. Ciò si ottiene fabbricando prima il dispositivo A-P-D-M-S utilizzando tecniche di litografia morbida a strati. Quindi una reazione di espressione proteica libera da cellule viene miscelata, introdotta nel dispositivo e si forma un insieme di reazioni isolate all'interno di una serie di micro camere fabbricate.

Successivamente, il dispositivo viene ripreso utilizzando la microscopia fluorescente time-lapse. Il passaggio finale consiste nel misurare l'intensità fluorescente di ciascun pozzetto nel tempo. In definitiva, queste tracce di fluorescenza vengono utilizzate per mostrare il rumore di espressione proteica nelle reazioni libere da cellule confinate.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come lo studio del rumore nelle cellule vive, è che i sistemi sintetici possono essere facilmente sondati per condizioni come il confinamento, che non possono essere facilmente controllate nei sistemi viventi. Per iniziare il processo di microfabbricazione, per prima cosa crea un rapporto in peso di 20 a uno della miscela PDMS misurando 10 grammi di base PDMS e 0,5 grammi di agente indurente in un piccolo piatto di plastica. In un altro piatto, pesare una miscela PDMS cinque a uno per una quantità sufficiente a riempire una valvola di controllo.

Stampo master fino a un centimetro di spessore. Mescolare entrambe le parti in modo uniforme con una spatola e posizionare i piatti all'interno di un essiccante sottovuoto per 20-30 minuti per degassare tutte le bolle dalla miscela durante il degasaggio. Posizionare lo stampo master della valvola di controllo in un contenitore di vetro.

Versare la miscela PDMS Degas cinque a uno sullo stampo della valvola di controllo. Trasferire il contenitore di vetro nell'essiccante sottovuoto e degassare il PDMS per altri 20-30 minuti. Quindi, posizionare il master a membrana su uno spin coder, Chuck e versare con cura un'aliquota del PDMS morbido 20 a uno sul wafer.

Centrifugare il wafer per 45 secondi per formare uno strato sottile di PDMS con uno spessore approssimativo da 30 a 60 micron dopo il degasaggio. Il master della valvola di controllo polimerizza parzialmente sia il wafer PDMS rivestito in centrifuga che il PDMS della valvola di controllo in un forno a 80 gradi Celsius per sei minuti e 15 minuti rispettivamente. Ispezionare l'entità dell'indurimento premendo delicatamente il blocco PDMS con una pinzetta o una spatola.

In caso di indurimento insufficiente, prolungare il tempo di incubazione per qualche minuto in più. A 80 gradi Celsius, un blocco PDMS parzialmente polimerizzato dovrebbe mantenere la sua forma Quando premuto con una combinazione di un bisturi e un paio di pinzette, tagliare e separare con cura i blocchi PDMS dal master della valvola di controllo, quindi perforare i fori di ingresso attraverso i blocchi PDMS utilizzando un punzone da 0,75 millimetri. Eliminare tutti i detriti intracanale inserendo un ago da 23 gauge con estremità smussata all'interno di ciascun foro e rimuovere i detriti esterni sulla superficie del PDMS con nastro di cellophane.

Per preparare le superfici per l'incollaggio tra PDMS e PDMS, posizionare il wafer PDMS rivestito di spin sul tavolino del microscopio. Spostare il tavolino e individuare i segni di allineamento del legame PDMS sul wafer per facilitare la complessità del successivo processo di allineamento manuale. Queste funzioni di ausilio all'allineamento visivo devono essere pre-progettate per essere adiacenti alle camere di reazione dei trucioli.

Una volta individuati i segni di allineamento sul wafer rivestito in rotazione, utilizzare una pinzetta incrociata per posizionare con cura il blocco PDMS della valvola di controllo sul wafer rivestito in rotazione con movimenti lenti e costanti. Individuare i segni di allineamento corrispondenti sul blocco PDMS della valvola di controllo superiore. Quando il blocco PDMS superiore è allineato otticamente con le corrispondenti funzioni di allineamento sul wafer rivestito in rotazione, premere delicatamente le due superfici PDMS a contatto l'una con l'altra.

Ispezionare la struttura allineata al microscopio per assicurarsi che sia le camere di reazione che i canali di ingresso siano visibili all'interno della regione rettangolare della valvola di controllo. Ripetere la procedura di allineamento e contatto interfacciale per gli altri componenti del dispositivo. Dopo che tutti i componenti sono stati allineati e dopo aver superato l'ispezione visiva, posizionare i componenti PDMS in un forno e polimerizzare a 80 gradi Celsius per due ore.

Questa fase di incubazione formerà successivamente un'interfaccia di legame P-D-M-S-P-D-M-S permanente. Estrarre la struttura PDMS incollata dal forno e raffreddarla a temperatura ambiente sul banco. Tagliare la struttura PDMS ed estrarre il chip PDMS incollato dal master in silicone utilizzando un punzone da 0,75 millimetri.

Perforare i fori di ingresso e uscita microfluidici. Rimuovere tutti i detriti all'interno della porta con un ago smussato calibro 23 per le fasi finali del processo di produzione dei trucioli. Posizionare la struttura PDMS e un vetrino di copertura con numero zero pulito all'interno della camera al plasma con la membrana PDMS e le interfacce di incollaggio del vetro entrambe rivolte verso l'alto del plasma.

Trattare entrambi gli elementi a 10,5 watt per 20 secondi con l'aria come fonte di gas. Rimuovere immediatamente il vetrino di copertura e il blocco PDMS dal pulitore al plasma. Dopo il trattamento, capovolgere con cautela il blocco PDMS e portare la superficie della membrana PDMS a contatto con il lato trattato al plasma del vetrino coprioggetti.

Infine, polimerizzare il dispositivo completato a 80 gradi Celsius per due ore per creare un'interfaccia di incollaggio PDMS in vetro permanente. Prima dell'esperimento, idratare il dispositivo PDMS facendolo bollire in acqua deionizzata per un'ora o immergendo il dispositivo per una notte in acqua sterile a temperatura ambiente. Inoltre, equilibrare la temperatura della camera ambientale del microscopio invertito a 30 gradi Celsius.

Successivamente, montare il chip PDMS idrato sul supporto del tavolino del microscopio con nastro di cellophane per evitare un'eccessiva disidratazione del chip durante le fasi di incubazione dell'esperimento. Avvolgere i bordi del dispositivo con carta velina bagnata per azionare le valvole di controllo PDMS e per controllare il processo di caricamento del campione all'interno della reazione principale. I trasduttori di pressione di tensione ad anello chiuso del canale due devono essere utilizzati per modulare la pressione dell'azoto gassoso per ciascun processo.

Inoltre, è necessario utilizzare una combinazione di tubi di calibro 24 e adattatori di blocco dell'esca maschio-maschio per semplificare le connessioni fluidiche tra i trasduttori e il chip per costruire le connessioni fluidiche della valvola di controllo. Prima a dedicare un trasduttore di pressione a questo compito, partendo dall'estremità del trasduttore, la prima porzione del percorso fluidico è costituita da un tubo per esche da 24 gauge non simmetrico collegato a un adattatore per esche da maschio a maschio, che viene poi collegato a un ago affilato da 23 gauge, che viene inserito in un serbatoio d'acqua per fiale di vetro da quattro millilitri dotato di un tappo a setto. Successivamente, la seconda parte del percorso della valvola di controllo è costituita da un ago affilato calibro 23, seguito da un adattatore per esche da maschio a maschio, che è collegato a un tubo simmetrico da 24 gauge e trainato con una serie di adattatori per esche da maschio a maschio collegati a un ago smussato da 23 gauge.

Per completare il gruppo della valvola di controllo, l'ago affilato calibro 23 viene inserito nel serbatoio dell'acqua, mentre il terminale dell'ago smussato verrà inserito nell'ingresso della valvola di controllo del dispositivo PDMS. Passando alla configurazione dell'ingresso della camera di reazione, il set di connettori del circuito del campione principale è costituito da un tubo di calibro 24 non simmetrico collegato a un adattatore per esca da maschio a maschio, seguito da un ago smussato di calibro 23 inserito in un tubo di calibro 24 e terminato con un ago smussato di calibro 23 inserito direttamente nel tubo senza un blocco dell'esca, L'estremità dell'esca femmina prossimale sarà attaccata alla siringa o a un secondo trasduttore di pressione durante la fase di caricamento del campione del protocollo. Mentre l'estremità distale dell'ago smussato sarà collegata all'ingresso della camera di reazione del dispositivo PDMS utilizzando un sistema di espressione proteica privo di cellule o CFPS in breve, segui il protocollo del produttore e prepara tutti i reagenti necessari su ghiaccio o in un blocco di ghiaccio per questo sistema microfluidico.

Un tipico volume di reazione CFPS per l'espressione costitutiva di GFP negli estratti di cellule intere di e coli è di circa 25 microlitri in ciascun saggio. Il plasmide del DNA deve essere aggiunto per ultimo per prevenire l'espressione prematura delle proteine fluorescenti. Il caricamento del campione sul chip microfluidico consiste in cinque fasi principali.

Per iniziare, collegare una siringa da un millilitro all'estremità dell'esca femmina del connettore dell'ansa del campione. Impostare Successivamente, inserire l'estremità dell'ago smussato del set di connettori in un tubo contenente la reazione CFPS e aspirare la miscela di reazione completamente assemblata nel tubo quando l'intera miscela di reazione è stata caricata nel circuito del campione. Estrarre l'estremità dell'ago smussato dalla provetta della microcentrifuga e inserire l'ago nell'ingresso della camera di reazione del chip al quarto passaggio.

Scollegare la siringa dall'ansa del campione e collegare l'estremità dell'esca femmina liberata dell'ansa del campione a un set di adattatori per esche maschili collegato a un secondo trasduttore di pressione. Infine, attivare il secondo trasduttore di pressione per avviare il caricamento del campione. Quando il canale microfluidico è stato riempito con i reagenti CFPS, rimuovere l'ago smussato dalla porta di ingresso del PDMS.

Inserire ora l'ago smussato collegato al primo trasduttore di pressione e al serbatoio dell'acqua nell'ingresso del canale della valvola di controllo. Dopo il caricamento del campione, aprire la camera ambientale e fissare il dispositivo PDMS sul tavolino del microscopio. Individuare le camere di reazione con un obiettivo a immersione in olio 100 x.

In condizioni di illuminazione a campo pieno, azionare il trasduttore di pressione della valvola di controllo a 20 PSI. La prova visiva dell'azionamento della valvola può essere vista osservando i cambiamenti di contrasto nello strato PDMS. Regolare la messa a fuoco in modo che il piano focale si trovi nella parte inferiore dell'interfaccia di classe PDMS del dispositivo.

Infine, impostare la frequenza di acquisizione dei dati su un'immagine al minuto e iniziare la microscopia a fluorescenza. Continuare a raccogliere dati fino a quando la sintesi proteica in tutti i pozzetti non ha raggiunto una fluorescenza stazionaria. Al momento della prima acquisizione dell'immagine, controllare il timer di laboratorio e registrare il tempo trascorso dall'introduzione del DNA nella reazione Dopo aver eseguito la microscopia a fluorescenza, iniziare il processo di analisi dei dati aprendo tutte le fotografie con un software di elaborazione delle immagini come image J.Selezionare l'interno delle camere di reazione come regione di interesse o ROI Per tutte le immagini, La fluorescenza totale della selezione sarà la traccia grezza di intensità della fluorescenza.

Utilizzando il gestore ROI, scegli le regioni di interesse intorno alla regione interna di ciascuna camera di reazione nella cassetta degli attrezzi, imposta le proprietà ROI automatiche su aree corrispondenti all'interno di ciascuna camera di reazione. Quindi controlla, aggiungi, fai clic e seleziona tutte le camere sullo schermo. Infine, evidenzia tutti i ROI.

Nel gestore del ROI. Utilizza la funzione multi misura per determinare l'intensità fluorescente media di ciascun ROI nell'intero stack di immagini. Con le tecniche di fabbricazione PDMS standard, la sintesi di GFP all'interno di ciascun pozzetto femtolitro è completamente isolata dal suo ambiente immediato e può essere interrogata individualmente mediante tecniche di imaging e fotobleaching, il tutto mediante l'azionamento definito dall'utente della valvola di controllo PDMS.

Con una vasta gamma di pozzetti, ciascuno dei quali si avvicina al volume intracellulare di un singolo batterio, la natura stocastica dell'espressione genica a livello di singola cellula può essere analizzata mediante quantificazione della fluorescenza intrapozzetto in funzione del tempo. Questo può essere paragonato allo stesso saggio di espressione proteica libera da cellule eseguito a un volume di reazione maggiore di 15 microlitri, in cui la natura stocastica del sistema di espressione è nascosta dietro la media d'insieme di numerosi segnali di fluorescenza, confrontando il profilo di espressione proteica tra un insieme di batteri vivi rispetto a singole reazioni prive di cellule a pozzetto singolo. Sebbene le grandezze di fluttuazione siano simili, l'autocorrelazione decade più rapidamente nei profili di espressione cell-free.

Il tempo di autocorrelazione nelle cellule è controllato dalla crescita e la diluizione della crescita della GFP non avviene nei sistemi privi di cellule. E invece, il tempo di autocorrelazione è controllato dal decadimento del tasso di sintesi proteica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le micro piattaforme artificiali come modelli per capire meglio come l'affollamento e il confinamento possono influire sui processi biologici.