Misura della larvali attività nel Drosophila Activity Monitor

Questo rapporto descrive un metodo per misurare l'attività larvale di Drosophila utilizzando il TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Il dispositivo utilizza raggi infrarossi per rilevare i movimenti di un massimo di 16 singoli animali. I dati possono essere analizzati per rappresentare i parametri di movimento, tra cui i tassi e le posizioni degli animali all'interno delle camere di saggio.

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare l'attività larvale senza l'uso di complicati software di analisi video. Ciò si ottiene trasferendo prima le larve selezionate in un filtro a rete per rimuovere i detriti. Successivamente, le singole larve vengono trasferite in provette di analisi, dove vengono fissate da tappi a coclea, che vengono inseriti in un dispositivo di monitoraggio dell'attività della drosofila o in una diga.

Dopo tre-cinque minuti di acclimatazione, le registrazioni vengono prelevate dal sistema DAM per l'analisi. In definitiva, i movimenti larvali misurati dalla madre possono essere utilizzati per analizzare diversi parametri di attività per un dato genotipo. Un vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che è automatizzata e obiettiva.

Pur essendo abbastanza semplici per le misurazioni di routine dell'attività, molti laboratori dispongono già dell'attrezzatura necessaria che può essere facilmente adattata per l'uso sulle larve. A dimostrare la procedura sarà Aiden McFarlin, uno studente universitario del mio laboratorio. Questo protocollo utilizza un dispositivo di monitoraggio dell'attività della drosofila multi-raggio M five o una diga.

Per installare la diga. Innanzitutto, collegare il monitor all'unità di interfaccia dell'alimentatore o PSIU utilizzando il cavo telefonico CAB six. Quindi collegare il PSIU a una presa di corrente.

Una luce verde indicherà una connessione appropriata. In terzo luogo, collegare il PSIU tramite un cavo USB a un computer per la registrazione dei dati. Ora installa e apri il programma DAM system MB one V six X sul computer.

Quando il software viene aperto, inizia automaticamente a registrare i dati nel controllo software. Per la diga impostare l'intervallo di registrazione desiderato. Scegli le preferenze e quindi fai clic sopra o sotto l'opzione dell'intervallo di lettura per selezionare diversi intervalli di tempo in cui verranno memorizzati i dati.

Ci sono una varietà di altri parametri che possono essere impostati in Preferenze e in Tipo di dati di output. Ogni parametro fornisce un'analisi unica dell'attività larvale all'interno della provetta. Si suggerisce di selezionare tutti i parametri prima della raccolta dei dati.

Se non si è sicuri di quale parametro si desidera misurare Per questo test, preparare una fiala con larve di foraggiamento per ogni genotipo che si intende analizzare. Utilizzare un ambiente standard e cibo per mosche per preparare le provette del saggio. Versare una soluzione di coclea al 4% a una profondità di 1,5 centimetri in una capsula di Petri.

Questo diventa il materiale del tappo per la provetta del saggio, troppo denso per essere scavato. Quindi, assicurati che i tubi siano puliti e non ostruiti lavandoli con acqua calda. Quindi, scalda una bottiglia da spremere con 100 millilitri di acqua in un forno a microonde per 10-15 secondi o fino a quando non appare la condensa.

Quindi capovolgere il flacone e spremere delicatamente l'aria calda e umida nella provetta del saggio. Quando un sottile strato di condensa appare sulla parete del tubo, è sufficientemente umido. Quindi, rimuovi il disco di gel dal piatto e mettilo su una superficie a rete, a cui non aderirà saldamente.

Per raccogliere le larve, preparare un filtro a rete stendendo una rete di nylon serigrafata su un imbuto. Fissare la rete al collo dell'imbuto con un elastico e posizionare l'imbuto in un bicchiere. Ora raccogli una spatola piena di cibo contenente larve di foraggiamento dalla bottiglia di coltura e trasferiscile nel filtro a rete.

Lavare via il cibo dalle larve usando acqua di rubinetto a temperatura ambiente, le singole larve possono essere raccolte dalla rete usando un pennello. Trasferisci le larve di circa 1,5 pollici in una provetta umida. Quindi sigillare il tubo tappandolo con la coclea.

Questo viene fatto premendo due volte un'estremità del tubo nel gel e l'altra estremità. Una volta che la pressione spinge uno dei due tappi all'estremità opposta, mentre i tubi vengono caricati, posizionarli nella diga. Quindi, regola la posizione di ciascun tubo in modo che l'animale non possa spostarsi oltre la portata dei sensori.

Quindi fissare i tubi al dispositivo utilizzando un anello di mastice. Registrare l'attività di LARVAS in un'incubatrice a 20 gradi Celsius per evitare letture imprecise che possono verificarsi a causa di ombre, luci fluorescenti o variazioni di temperatura in laboratorio. Nell'incubatrice.

Utilizzare un'illuminazione a LED non fluorescente durante la registrazione. Prima di raccogliere i dati, lasciare che le larve si acclimatino per cinque minuti. Può essere utile eseguire una prova senza animali per assicurarsi che le condizioni di luce non attivino i sensori DAM.

Dopo cinque minuti, avviare il software DAM preconfigurato per avviare la registrazione. Il test può durare 30 minuti senza ulteriore condensa o cibo. È essenziale che prima della registrazione sia stato selezionato il parametro di attività destinato all'analisi in Preferenze.

Se non è selezionata, questa attività non sarà disponibile per l'analisi post hoc. Al termine del tempo di registrazione desiderato, chiudere il software DAM, i dati vengono salvati automaticamente nella cartella dei dati del sistema DAM. Trasferire il file di dati in una cartella separata in modo che possa essere elaborato in un secondo momento.

Le provette del saggio possono essere pulite con acqua bollente per essere riutilizzate. Per elaborare i dati grezzi in un formato comprensibile, apri l'applicazione di scansione dei file DAM e scegli. Seleziona la cartella dei dati di input, quindi scegli la cartella dei dati e il file desiderato e seleziona l'opzione di scansione.

Infine, selezionare la lunghezza del contenitore fino al periodo di lettura desiderato. In questo modo i dati grezzi vengono organizzati in parametri impostati dall'operatore. Ora seleziona il tipo di dati di output per analizzare l'impostazione di movimento desiderata.

Se la lunghezza del contenitore è maggiore dell'intervallo di lettura del sistema selezionato, accedere al menu Letture extra e selezionare l'opzione due somma in contenitori. Quindi, salva il file con un nome appropriato nella stessa cartella in cui sono stati trasferiti i dati grezzi. Utilizzando un normale programma per fogli di calcolo, apri il file salvato.

A seconda del tipo di dati analizzati, il foglio di calcolo deve essere letto in modo diverso. In genere, per misurare le mosse o i conteggi, il periodo di tempo dello studio verrà registrato numericamente mentre ogni singolo tubo di lettura riceverà una lettera designata. Normalmente le colonne dalla K alla Z rappresentano le fessure per le provette e le righe rappresentano i punti dati raccolti.

Se, ad esempio, le mosse sono state raccolte per 20 minuti, in un minuto, gli intervalli fanno la media delle 20 righe per calcolare un numero medio di mosse al minuto e altre misurazioni. Uno studio di risposta alla temperatura delle larve del terzo stadio del ceppo W 1 1 1 8 è stato condotto utilizzando il dispositivo di monitoraggio per rilevare le differenze nella locomozione delle larve. A sette diverse temperature, ogni larva è stata analizzata per 20 minuti.

Chiaramente, le larve sono diventate significativamente più attive man mano che l'ambiente si riscaldava. Per confronto, è stato testato un mutante ipoattivo del ceppo W 1 1 18 chiamato inattivo. L'analisi ha indicato che le larve inattive erano significativamente meno mobili di un controllo per testare i limiti di rilevamento del test.

È stato effettuato un confronto tra larve in diversi stadi, molto più piccole del terzo nelle larve stellari. L'attività della prima e della seconda nelle larve stellari era infatti rilevabile e misurabile osservando i cambiamenti di attività nel tempo nel dispositivo. È stato riscontrato che l'attività del terzo nelle larve stellari in ogni minuto del saggio di 20 minuti è rimasta relativamente costante.

Una volta padroneggiato, questo protocollo fornisce un metodo accurato, semplice ed economico per valutare i parametri di base dell'attività larvale in una varietà di condizioni sperimentali.