Deacetilazione saggi di svelare l'interazione tra sirtuine (SIRT2) e specifici Protein-substrati

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per eseguire saggi di deacetilazione in vitro e in vivo al fine di stabilire il ruolo delle proteine come substrati specifici di deacetilazione per le sirtuine e studiare ulteriormente il ruolo dell'acetilazione reversibile della lisina come modifica post-traduzionale.

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di eseguire saggi di deacetilazione in vitro e in vivo al fine di stabilire il ruolo delle proteine come substrati specifici di deacetilazione per le sirtuine. Nonostante il numero crescente di proteine acetilate, che sostengono una presenza diffusa di acetilazione, non sono ancora stati identificati enzimi specifici che regolano queste modificazioni per la maggior parte di queste proteine. Il vantaggio principale di questi saggi è che, stabilendo una proteina come substrato legittimo di una specifica deacetilasi, è possibile svelare nuovi ruoli e funzioni della deacetilasi.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'identificazione del substrato specifico della sirtuina 2, può anche essere applicato, con piccole modifiche, ad altri membri della famiglia delle sirtuine. Per iniziare questa procedura, preparare una piastra di coltura di 10 centimetri di cellule T HEK 293 in otto millilitri di DMEM, con il 10% di FBS in antibiotici, in modo che le cellule siano circa il 70% confluenti dopo la crescita durante la notte. Il giorno seguente, cotrasfettare le cellule con i seguenti elementi: quattro microgrammi di lentivettore, che esprimono GFP e SIRT2 marcata con FLAG, quattro microgrammi di vettore di imballaggio e 0,5 microgrammi di vettore di busta.

Utilizzare la polietilenimmina, o PEI, in un rapporto di tre microlitri di PEI per microgrammo di DNA. 12 ore dopo la trasfezione, cambiare il terreno. Da 36 a 48 ore dopo, raccogliere il surnatante.

Rimuovere i detriti mediante centrifugazione a 1.000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver filtrato attraverso un filtro da 0,22 micrometri, fare un'aliquota di un millilitro di lentivirus SIRT2 e conservarla a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Quando è pronto per infettare le cellule, scongelare il lentivirus SIRT2 con ghiaccio.

Infettare una piastra a sei pozzetti di cellule T HEK 293 confluenti all'80-90% con un millilitro di lentivirus in presenza di otto microgrammi per millilitro di Polybrene. Metti le cellule infettate dal virus in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, sostituire il fluido.

48 ore dopo l'infezione, verificare l'efficienza dell'infezione rilevando le cellule GFP-positive al microscopio a fluorescenza. Se l'efficienza dell'infezione è almeno del 40-50%, sostituire il terreno con un terreno di coltura contenente due microgrammi per millilitro di puromicina per selezionare cellule stabili che sovraesprimono SIRT2. Rimetti le cellule nell'incubatore.

La selezione per le cellule stabili che sovraesprimono SIRT2 richiederà circa due settimane e il terreno deve essere cambiato ogni tre o quattro giorni. Per la purificazione con SIRT2, preparare almeno 10 piastre da 10 centimetri di cellule T HEK 293 che esprimono FLAG SIRT2. Dopo 24 ore, rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule due volte in PBS e raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione, seguita da centrifugazione a 1.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Lisi il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone di lisi A per piatto che include un cocktail di inibitori della proteasi e un micromolare di TSA, un inibitore dell'istone deacetilasi non di classe tre. Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius in rotazione costante. Dopo 30 minuti, centrifugare a 14.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Eseguire l'immunoprecipitazione utilizzando un anticorpo anti-FLAG coniugato a perle di agarosio. Aggiungere da 200 a 300 microlitri di anticorpo anti-FLAG al lisato proteico e incubare a quattro gradi Celsius con agitazione costante per una notte.

Il giorno successivo, raccogliere gli immunoprecipitati mediante centrifugazione a 1.000 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Lavare il pellet cinque volte con 10 millilitri di tampone di lisi A.Dopo il quinto lavaggio, rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di una soluzione peptidica X FLAG che include un cocktail di inibitori della proteasi e TSA alle perle di agarosio. Incubare a quattro gradi Celsius, a rotazione costante, per 30 minuti.

Raccogliere il surnatante per centrifugazione a 6.000 g per due minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere le perle di agarosio dal surnatante utilizzando tubi filtranti e centrifugando a 15.000 g a quattro gradi Celsius per un minuto. Infine, utilizzare una membrana di ultrafiltrazione per concentrare il campione eluito fino a quando la concentrazione proteica finale è di un microgrammo per microlitro.

Mantenere la SIRT2 purificata a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Inizia questa procedura preparando 10 piastre di coltura da 10 centimetri di cellule T HEK 293, in modo che siano confluenti per circa il 70% il giorno successivo. Il giorno seguente, cotrasfettare le cellule con cinque microgrammi di un infettatore plasmatico marcato con FLAG che esprime la proteina-substrato e cinque microgrammi della specifica acetiltransferasi che può acetilare la proteina.

Se l'acetiltransferasi specifica non è nota, utilizzare una miscela di acetiltransferasi istoniche note. Utilizzare il PEI in un rapporto di tre microlitri di PEI per microgrammo di DNA. Incubare le cellule trasfettate per 12 ore.

Quindi, cambiare il terreno e incubare le cellule per 24 ore. Trattare le cellule con un TSA micromolare e due nicotinamide millimolari per 12 ore sostituendo il terreno di coltura con un terreno contenente TSA e nicotinamide. Ciò massimizzerà i livelli di acetilazione del substrato proteico inibendo le deacetilasi.

48 ore dopo la trasfezione, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule due volte con PBS. Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione, seguita da centrifugazione a 1.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per lisare il pellet cellulare, aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi A per piatto, che include un cocktail di inibitori della proteasi, un TSA micromolare e due nicotinamide millimolare, e incubare a quattro gradi Celsius, a rotazione costante, per 30 minuti.

Centrifugare a 14.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Eseguire l'immunoprecipitazione utilizzando un anticorpo anti-FLAG coniugato a perle di agarosio, come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver concentrato il campione eluito a un microgrammo per millilitro, mantenere il substrato proteico acetilato purificato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Un passaggio critico di questo protocollo consiste nel confermare la purificazione del substrato proteico acetilato da parte della proteina, utilizzando un anticorpo specifico per la proteina e un anticorpo anti-acetilazione prima della reazione di deacetilazione in vitro. Prima di iniziare la reazione di deacetilazione in vitro, preparare il tampone di deacetilazione B.Successivamente, preparare tre reazioni in tre diverse provette, ciascuna in un volume totale di 20 microlitri, come mostrato in questa tabella. Tutte e tre le provette contengono un substrato proteico acetilato purificato e il tampone di deacetilazione B, ma la seconda provetta contiene anche SIRT2 purificato e la terza provetta contiene anche SIRT2 e NAD plus purificati.

Per confermare la deacetilazione della proteina-substrato da parte di SIRT2, può essere inclusa una quarta reazione opzionale, in cui viene aggiunto un mutante nullo deacetilasi purificato di SIRT2 al posto della SIRT2 attiva con deacetilasi. Incubare le reazioni a 30 gradi Celsius sotto costante agitazione per tre ore. Arrestare le reazioni aggiungendo 20 microlitri di due X tampone campione a ciascuna provetta e facendo bollire i campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti.

Successivamente, le miscele di reazione vengono eseguite su un gel di pagina SDS dal 4 al 12% e lo stato di acetilazione della proteina-substrato viene rilevato mediante Western blotting, utilizzando un anticorpo contro la lisina acetilata. Utilizzando questo protocollo, SIRT2 wild-type e un mutante difettoso di deacetilazione, SIRT2 Hi87Y, sono stati purificati a una concentrazione finale di un microgrammo per microlitro. Poiché entrambe le proteine sono marcate con un peptide FLAG, la purificazione può essere confermata mediante immunoblotting, utilizzando un anticorpo anti-FLAG.

Anche il substrato proteico e il substrato proteico acetilato sono stati purificati. L'immunoblotting con un anticorpo anti-acetil lisina ha confermato l'aumento dei livelli acetilati della proteina purificata nelle cellule che sovraesprimono le acetiltransferasi. Le proteine totali sono state rilevate utilizzando un anticorpo anti-FLAG.

In un test di deacetilazione in vitro, quando il substrato proteico acetilato purificato è stato incubato con SIRT2 wild-type o con il mutante difettoso di deacetilazione in presenza di NAD plus, sono stati rilevati livelli ridotti di acetilato mediante immunoblotting, utilizzando un anticorpo anti-acetil lisina in presenza di SIRT2, ma non in presenza del mutante. Non è stata osservata alcuna attività di deacetilazione quando NAD plus non è stato incluso nella miscela di reazione, confermando che SIRT2 richiede NAD plus per la sua funzione enzimatica. La deacetilazione è stata inibita anche quando un inibitore delle sirtuine, NAM, è stato aggiunto alla miscela di reazione, il che implica che la diminuzione dei livelli acetilati della proteina è mediata dall'attività deacetilasi di SIRT2.

Affinché una proteina possa essere considerata come bersaglio di deacetilazione per qualsiasi enzima, è necessario eseguire un saggio di deacetilazione sia in vitro che in vivo per stabilire l'interazione tra la deacetilasi e ciascun substrato. I saggi di deacetilazione in vivo in cellule in specifiche condizioni sperimentali possono fornire ulteriori informazioni sull'interazione tra la deacetilasi e il potenziale substrato in scenari fisiologici e fisiopatologici, e stabilire il ruolo funzionale dell'evento di deacetilazione, in un contesto fisiologico. Dato il crescente interesse per il ruolo delle sirtuine nella regolazione di diversi processi cellulari, i saggi di deacetilazione descritti possono essere utilizzati con lievi modifiche per identificare nuovi substrati per altri membri della famiglia delle sirtuine, indipendentemente dalla loro localizzazione subcellulare.

Sia i saggi di deacetilazione in vitro che quelli in vivo effettuati con deacetilasi specifiche possono essere ulteriormente combinati con analisi di spettrometria di massa su piccola scala per rivelare lisine bersaglio sul substrato per distinguere i siti di acetilazione funzionale dalle lisine acetilate non regolatorie.