Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del Ex Vivo Mouse Ear pelle

L'obiettivo generale di questo nuovo protocollo sperimentale è quello di dimostrare l'accessibilità dei follicoli piliferi nell'orecchio del topo, per studiare la funzione dei terminali nervosi meccanosensoriali completamente differenziati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze meccanosensoriali, come il ruolo delle vescicole sinaptiche nella sensazione meccanica. I due principali vantaggi di questa tecnica sono che è veloce e offre un facile accesso ottico a innumerevoli terminali nervosi meccanosensoriali viventi completamente differenziati.

In generale, gli individui nuovi a questo metodo possono avere difficoltà a ottenere la separazione della pelle e a liberare adeguatamente la cartilagine senza danneggiare i follicoli. Oltre a mostrare la tecnica di base, qui mostreremo anche l'esempio di un esperimento, osservando la dipendenza dal calcio di una parte vitale della funzione del terminale nervoso. Riempi un piatto rivestito di silicone da 50 millimetri con la soluzione di Liley o altra soluzione fisiologica.

Aggiornare la soluzione ogni 15 minuti o utilizzare una perfusione costante. Dopo aver decapitato un giovane topo adulto, usando le forbici, rimuovi le orecchie esterne vicino alla base, appena sopra l'attaccatura densa dei capelli, e trasferisci i padiglioni auricolari nel piatto. Ora, appunta un orecchio, con il lato concavo rivolto verso il basso, lungo i margini, usando degli spilli da insetto sottili.

Quindi, staccare con cura la pelle posteriore esposta usando la dissezione smussata. Usando la pinza numero 3, afferrare la pelle posteriore centrale e, con un altro paio di pinze, perforare lo spazio tra la pelle e la cartilagine alla base dell'orecchio. Lavorare delicatamente la pinza da un lato all'altro all'interno dello spazio, separando gradualmente gli strati di pelle anteriore e posteriore.

Spostarsi sistematicamente attraverso la cartilagine centrale fino ai margini sottili privi di cartilagine. Questo richiederà pratica. Dopo aver rimosso la pelle posteriore, fissarla, con il lato dermico rivolto verso l'alto, vicino alla pelle anteriore.

Una volta rimossa la cartilagine su entrambi i preparati cutanei, rimuovere lo strato di cartilagine fibroelastica schiumosa che copre la base dei follicoli piliferi. Sbucciare, strappare e strofinare delicatamente questo fazzoletto. Anche questo richiederà pratica per essere padroneggiato.

La rimozione di troppo poco ostruisce il colorante e la sua visualizzazione, mentre la rimozione di troppo danneggia le terminazioni nervose. L'uso di un topo giovane riduce al minimo l'adesione tra gli strati cutanei anteriori e posteriori e la difficoltà di rimuovere la cartilagine sottostante. Entrambi aumenteranno la probabilità di vedere una colorazione di successo.

Ogni preparazione di pelle può essere tagliata a metà dall'apice alla base, per massimizzare il numero di replicanti e ridurre al minimo gli animali utilizzati. Questa sezione descrive come colorare i tessuti con FM1-43, ma dovrebbe funzionare con la maggior parte degli altri coloranti di stiril piridinio di questa classe con un adeguato aggiustamento delle concentrazioni. Eseguire questa procedura con livelli minimi di luce ambientale.

Prima di iniziare, preparare una quantità sufficiente di 10 micromolari FM1-43 freschi nella soluzione fisiologica gassata appropriata per 3 millilitri per preparazione. Mettere ogni preparazione in un piatto separato da 35 millimetri rivestito di silicone, con 2 millilitri di soluzione salina appropriata. Per confrontare la capacità del calcio e del bario di sostenere l'assorbimento del colorante, incubare in piatti separati da questo punto.

Metti un po' nel normale calcio di Liley da 2 millimolari e altri in quello di Liley dove il bario sostituisce il calcio. Quindi, posizionare le preparazioni del piatto aperto su una piattaforma leggermente sommersa in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius. La profondità dell'acqua dovrebbe essere sufficiente per riscaldare i tessuti senza rovesciarsi nel piatto.

In ogni piatto, appuntare una sottile linea di gas sulla base di silicone per gasare le preparazioni a circa 10 bolle al secondo. Inoltre, riscaldare le soluzioni FM1-43 e 100 millilitri di soluzione salina senza coloranti in flaconi con tappo ermetico. Lascia che il tutto si equilibri a 30 gradi Celsius e, dopo 30 minuti, sostituisci la soluzione salina senza colorante sul tessuto utilizzando l'apposita soluzione riscaldata.

Incubare per altri 30 minuti. Dopo l'incubazione, versare la soluzione salina priva di coloranti e asciugare rapidamente e con cura il liquido rimasto intorno al preparato. Fare attenzione a non toccare le superfici dermiche esposte.

Rimettere i preparati nel bagnomaria, mantenendo le linee di gasaggio in posizione per tutto il tempo. Ora aggiungi da 2 a 3 millilitri di soluzione colorante calda contenente calcio o bario. Dopo 40 minuti, riportare i tessuti a temperatura ambiente per il resto della procedura, per inibire il rilascio successivo del colorante internalizzato.

Ora, rimuovere il colorante non internalizzato in tre fasi: in primo luogo, versare la soluzione di etichettatura e sciacquare rapidamente i fazzoletti tre volte con soluzione fisiologica a temperatura ambiente in rapida successione, quindi lasciarli incubare per 30 minuti per dedividere la maggior parte del colorante rimanente dalle membrane superficiali. Infine, rimuovere il colorante persistente attaccato al lembo esterno delle membrane esposte chelando il preparato con un derivato della b-ciclodestrina solfonato, costituito in soluzione salina di calcio o bario a seconda dei casi. Pertanto, tutto il colorante rimanente sarà all'interno dei tessuti.

Dopo la chelazione, rimettere i preparati nell'apposita soluzione salina fresca senza coloranti e asciugare accuratamente l'esterno delle stoviglie con carta velina. Quindi, immaginali il prima possibile. Continuare a funzionare in condizioni di luce ambientale minima.

Prima dell'imaging, utilizzando uno stereomicroscopio, rimuovere i detriti superficiali che si autofluorescerebbero e contaminerebbero le immagini. Quindi, posizionare la capsula sotto un microscopio a epifluorescenza verticale con un set di filtri standard per fluoresceina. Quindi, attenuare l'intensità della luce di eccitazione utilizzando filtri a densità neutra fino a quando la preparazione non è illuminata quanto basta per localizzare comodamente i terminali nervosi.

L'illuminazione completa ucciderà i terminali nervosi piuttosto rapidamente. Una volta individuati, acquisisci le immagini dei terminali lanceolati etichettati utilizzando un obiettivo a secco 10x o un obiettivo a immersione in acqua 20x. Riduci al minimo l'intensità della luce e il tempo di esposizione utilizzando un tempo di integrazione della fotocamera da 1/2 a 1 secondo.

Per ogni preparazione, immaginare circa 20 terminazioni lanceolate, partendo dal margine più lontano dal bordo tagliato della base della pelle del padiglione auricolare, e lavorando lungo questo margine, immaginando ogni follicolo a turno. Lavora in campi leggermente sovrapposti paralleli al bordo tagliato senza eseguire l'imaging dello stesso follicolo due volte o l'imaging di follicoli palesemente danneggiati. Dopo aver completato la striscia marginale, spostare la larghezza di un campo verso la base del padiglione auricolare e ripetere il processo nella direzione opposta.

L'analisi è descritta nel protocollo di testo. Dopo aver eseguito l'imaging del primo piatto, che mostra i follicoli marcati in soluzione salina contenente calcio, visualizzare i follicoli in soluzione salina contenente bario. Continuate in questo modo.

Assicurarsi che l'imaging dei restanti tessuti di controllo e sperimentali corrisponda al tempo, poiché dopo la marcatura, il colorante verrà successivamente rilasciato nuovamente dal braccio di esocitosi del riciclo costitutivo dell'SLV. In una tipica preparazione di padiglioni auricolari, i follicoli piliferi sono facilmente visibili in transilluminazione senza fluorescenza, illustrando la natura sottilissima della preparazione e la relativa facilità di accessibilità che offre a questi terminali meccanosensoriali. Sotto epifluorescenza, i terminali lanceolati marcati che circondano ciascun follicolo pilifero sono chiaramente visibili e mostrano l'assorbimento spontaneo tipicamente robusto di FM1-43.

Il modello punteggiato riflette i terminali osservati in un piano ottico ortogonale alla pelle, lungo la lunghezza del terminale. Una delle tante applicazioni di questo metodo è nello studio della cinetica dell'esocitosi. Come previsto, se l'assorbimento del colorante è dovuto al riciclo delle vescicole, nei pannelli superiori si vede un terminale etichettato che si decolora spontaneamente.

Dopo aver applicato un potente stimolante dell'esocitosi, l'alfa-latrotossina, il naturale processo di decolorazione viene accelerato, come si vede nei due pannelli inferiori. Un'altra applicazione, come osservato nel video, è quella di esaminare la dipendenza dal calcio dell'endocitosi. È stato osservato un distinto assorbimento di colorante per i terminali lanceolati sia nelle saline contenenti calcio che in quelle contenenti bario.

Quantificando l'intensità della fluorescenza del terminale visto etichettare durante il video, non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nell'assorbimento del colorante. Ciò indica che l'endocitosi è supportata ugualmente bene dal bario e dal calcio. Ulteriori ripetizioni della procedura su altre preparazioni auricolari verificheranno questa conclusione.

Una volta padroneggiato, l'intero protocollo e l'imaging possono essere completati in due ore e mezza. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di utilizzare topi piccoli, di sezionare rapidamente e di adattarsi al massimo al buio per ridurre al minimo l'intensità della luce richiesta. Abbiamo adattato l'idea di questo metodo da quella originariamente sviluppata da un collega stretto e professore ora in pensione, Clarke Slater, e dal suo studente di Master Michael Caine.

Quando abbiamo detto loro del possibile ruolo delle vescicole sinaptiche nella meccanosensazione nel fuso muscolare, ma della necessità di un modo migliore di visualizzare rispetto a FM1-43. Questa procedura può essere utilizzata anche in combinazione con altri metodi, come la farmacologia e l'elettrofisiologia. Quindi possiamo studiare come viene regolato il riciclaggio delle vescicole sinaptiche e come questo si collega alla reattività delle terminazioni meccanosensoriali.