Name: Exosomal Analisi miRNA in non a piccole cellule del cancro del polmone (NSCLC) dei pazienti plasma attraverso qPCR: Un fattibile Liquido biopsia Strumento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Impara a isolare esosomi puri dal plasma di pazienti con NSCLC mediante trattamento enzimatico doppio. Questo metodo migliora l'analisi dei microRNA come biomarcatori per la diagnosi del cancro del polmone.

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Questo studio è stato finanziato anche dal MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) grant 2014.

1. Isolamento Exosome Nota: L&#39;isolamento di esosomi da campioni di plasma, è stato eseguito con un kit commerciale, secondo il protocollo del produttore e con l&#39;aggiunta di un trattamento RNAsi: (tutti questi passaggi devono essere eseguite con dispositivi di protezione personale e dell&#39;ambiente, secondo procedura giuridica specifica per la manipolazione di campioni biologici ). <ol><li> Prendere 1 ml di plasma di ogni campione, conservati a -80 ° C, e posizionarlo sul ghiaccio. </li><li> Centrifugare il campione a 2000 xg per 20 minuti a RT; questo passaggio è obbligatorio per rimuovere le cellule e detriti. </li><li> Trasferire il surnatante contenente il plasma pulito in una nuova provetta da 1,5 ml. </li><li> Centrifugare il nuovo tubo a 10.000 xg per 20 minuti a RT. </li><li> Trasferire il surnatante contenente il plasma pulito in una nuova provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 100 ng / ml di RNAsi al supernatante e incubare il tubo a 37 ° C per 10 min inper degradare RNA circolante. </li><li> Trasferire tutto il plasma trattato in una nuova provetta 2 ml e aggiungere 0,5 volume di PBS 1x. </li><li> Agitare il campione al fine di mescolare le soluzioni. </li><li> Aggiungere 0,05 volumi di soluzione proteinasi K (racchiudere nel kit) al campione. </li><li> Vortex campione e incubare a 37 ° C per 10 min. </li><li> Aggiungere 0,2 volumi di tampone exosome precipitazioni al campione e mescolare le soluzioni per inversione. </li><li> Incubare il campione a 2 ° C a 8 ° C per 30 min e poi centrifugare il campione a 10.000 xg per 5 minuti a RT. </li><li> Aspirare e scartare il surnatante. Il pellet contiene i exosomes isolati. </li><li> Aggiungere tampone selezionato al pellet exosome per risospendere le esosomi. La selezione del buffer dipende dall&#39;analisi valle prevista, in questo caso: <ol><li> Aggiungere 100 pl di PBS 1x per eseguire analisi TEM. </li><li> Aggiungere 346,5 ml di specifica buf lisiFer per l&#39;estrazione di RNA (dal kit commerciale) (ATTENZIONE: rischio chimico). </li><li> Aggiungere 100 pl di tampone di lisi per l&#39;estrazione delle proteine ​​(Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - leupeptina / Aprotinin 10 ug / ml) per eseguire l&#39;analisi Western Blotting. (ATTENZIONE: rischi chimici). </li></ol></li><li> Conservare le exosomes risospeso a -20 ° C. </li></ol> 2. Exosome Caratterizzazione da Analysis Western Blot Nota: Al fine di caratterizzare i nanovesicles isolate, si raccomanda western blotting con anticorpi contro ALIX e Tsg101 (ben noti marcatori exosomal). <ol><li> Dopo risospensione del pellet exosome in Lysis buffer, posizionarlo in ghiaccio per 1 ora in modo da sciogliere la membrana exosomal. </li><li> Centrifugare il lisato a 12,000 g per 10 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta senza disturbare il pellet. </li><li> Quantificare il conten totale di proteine ​​exosomalt da Bradford Assay o altri metodi e carico di 50 ug di proteine ​​per pozzetto in Tris / glicina SDS - gel di poliacrilammide all&#39;8%. (ATTENZIONE: rischi chimici). </li><li> Separare le proteine ​​(e di un indicatore di peso molecolare appropriato) a 8% SDS-PAGE elettroforesi su gel con tampone di corsa (25 mM Tris, 192 mm glicina, 0,1% SDS) per 1 ora e 30 min a 120 V. (attenzione: rischi chimici ). </li><li> Trasferire la proteina ad una membrana di nitrocellulosa da elettroblotting con 4 ° C buffer di trasferimento fredda (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanolo) per 1 ora a 50 V. costante (NOTA: rischi chimici). </li><li> Bloccare la membrana per 1 ora in agitazione lenta con il 5% di latte secco non grasso in 1x TBS -Tween 0,1%. </li><li> Lavare la membrana 4 volte per 5 min in agitazione veloce con 1x TBS - Tween 0,1%. </li><li> Aggiungere gli anticorpi primari contro ALIX e Tsg101 (uno per membrana) in tampone appropriato (di conseguenza la scheda tecnica degli anticorpi dal produttore) e incubare la membrana O / N; In lenta agitazione. </li><li> Lavare la membrana 5 volte per 5 min in rapida agitazione con 1x TBS - Tween 0,1% per rimuovere l&#39;anticorpo eccessiva. </li><li> Aggiungere l&#39;anticorpo secondario appropriato tampone appropriato (di conseguenza la scheda tecnica degli anticorpi dal produttore) e incubare la membrana per 1 ora in agitazione lenta. </li><li> Lavare la membrana 5 volte per 5 min in rapida agitazione con 1x TBS - Tween 0,1% per rimuovere l&#39;anticorpo eccessiva. </li><li> Rilevare la proteina selezionato mediante l&#39;analisi chemiluminescenza 11. </li></ol> 3. Caratterizzazione Exosome da Analysis TEM Nota: Per visualizzare i esosomi isolati, TEM (Transmission Electron Microscopy) analisi è stata effettuata. <ol><li> Luogo ~ 10 mcg (precedentemente quantificati da saggio Bradford) del campione di esosomi intatto risospesi in PBS 1x su una parafilm e mettere sul campione cadere un carbonio griglia di nichel rivestito Formvar per 1 ora. </li> &lt;li&gt; Lavare la griglia 3 volte posizionandola su tre di 40 microlitri 1x gocce di PBS. </li><li> Lavare la griglia 5 volte posizionandolo su cinque 30 microlitri gocce d&#39;acqua ultrapura. </li><li> Fissare il campione aggiungendo una goccia di 2,5% glutaraldeide (ATTENZIONE: rischio chimico) per 10 min. </li><li> Lavare la griglia 3 volte posizionandolo su tre 40 microlitri 1x gocce PBS. </li><li> Aggiungere una goccia del 2% acetato di uranile (NOTA: rischi chimici) e mettere la griglia su di esso per 15 minuti per contrastare il campione. </li><li> Incorporare il campione su una goccia di 0,13% metilcellulosa (NOTA: rischi chimici) e lo 0,4% acetato di uranile e incubare la griglia sulla parte superiore della goccia per 10 min. </li><li> Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso con carta assorbente ed asciugare la griglia per 5 min con il lato rivestito up. </li><li> Esaminare la griglia di trasmissione microscopio elettronico a 12. </li></ol> 4. Exosomal RNA Estrazione e quantificazione Nota: Abbiamo deciso di Perform l&#39;estrazione totale RNA da campioni exosomal utilizzando un kit commerciale, secondo il protocollo del produttore: (ATTENZIONE: rischio chimico, rivedere il protocollo e le linee guida del produttore). <ol><li> Dopo la risospensione del pellet exosome a 346,5 ml di tampone di lisi, aggiungere 3,5 ml di β-mercaptoetanolo (ATTENZIONE: rischi chimici) e vortex con forza; questo passaggio è obbligatorio al fine di distruggere le membrane lipidiche. </li><li> Aggiungere il lisato alla colonna di lavaggio in un tubo di raccolta e centrifugare a 11.000 g per 1 min. Dopo la centrifugazione, scartare la colonna e trasferire il filtrato in un nuovo tubo di 1,5 ml RNasi-free. </li><li> Aggiungere 350 ml di etanolo al 70% (ATTENZIONE: rischi chimici) e mescolare nel vortex per 5 secondi. </li><li> Caricare il lisato nella colonna risoluzione e centrifugare per 30 secondi a 8000 × g. Dopo centrifugazione, eliminare l&#39;eluato e trasferire la colonna in un tubo di raccolta. </li><li> Caricare 350 ml di dissalazione Buffer e centrifugare a 11.000 g per 1 min. Dopo la centrifugazione, eliminare l&#39;eluato e restituire la colonna nella stessa provetta di raccolta. </li><li> Aggiungere 95 ml di miscela di reazione DNasi I (10 ml di DNasi ricostituito I + 90 ml di tampone DNasi, per ogni campione) sulla membrana di silice della colonna e incubare a RT per 15 minuti a RT. (ATTENZIONE: rischio chimico) </li><li> Aggiungere 200 ml di tampone di lavaggio (ATTENZIONE: rischio chimico) alla colonna e centrifugare a 11.000 g per 1 min. Porre la colonna in un nuovo tubo di raccolta. </li><li> Aggiungere 600 ml di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 11.000 g per 1 min. Dopo la centrifugazione, scartare eluato e posizionare la colonna nella stessa provetta di raccolta. </li><li> Aggiungere 250 pl di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare a 11.000 g per 2 min. Porre la colonna in un tubo RNasi-free 1,5 ml. </li><li> Eluire l&#39;RNA in 40 ml di acqua RNase-free e centrifugare a 11.000<html> 5; g per 1 minuto, in modo da avere una concentrazione elevata di RNA in questo piccolo volume. </li><li> Porre immediatamente RNA eluito su ghiaccio per prevenire i potenziali danni o conservare a -80 ° C. </li><li> Quantificare il contenuto di RNA. Nota: Qui, la quantizzazione RNA è stata effettuata utilizzando 1 ml di campione attraverso spettrofotometro. </li></ol> 5. Retrotrascription dei miRNA Exosomal Nota: A causa della quantità limitata descritto di contenuti miRNA in esosomi, si è deciso di eseguire la trascrizione inversa di miRNA selezionati mediante un kit commerciale utilizzando un test individuale per ciascun miRNA, secondo il protocollo del produttore. Per ogni campione, 8 miRNA correlate allo stato di NSCLC sono stati selezionati (miR-30b; miR-30c, miR-103, miR-122, miR-195, miR-203, miR-221, miR-222 e miR-1228- 3p come controllo endogeno). <ol><li> Preparare la master mix di trascrizione inversa (RT mix). Per ogni reazione preparare 7 ml di RT mix, come descritto inhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx&quot;&gt;Table 1 (clicca qui per scaricarlo) (ATTENZIONE: rischio chimico). Nota: In questo esperimento, 9 diverso mix RT sono stati preparati per ogni campione. </li><li> Mescolare delicatamente e conservare la miscela RT sul ghiaccio. Aggiungere 7 ml di RT mix per provetta di reazione. </li><li> Aggiungere 5 ml di RNA del campione (10 mg di RNA totale) per ogni tubo di reazione e mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungere 3 ml di primer trascrizione inversa 5x (ATTENZIONE: rischio chimico) da ogni saggio impostare nel tubo di reazione corrispondente. </li><li> Mescolare lentamente, chiudere il tubo e incubare in ghiaccio per 5 min. </li><li> Caricare il tubo di reazione nel termociclatore e avviare la reazione di trascrizione inversa utilizzando i seguenti valori di parametro (HOLD a 16 ° C per 30 minuti; tenere a 42 ° C per 30 minuti; tenere a 85 ° C per 5 minuti; tenere premuto ∞ 4 ° C). </li></ol> 6. Tempo reale analisi PCR di Exosomal miRNA Nota: Questa analisi è stataeseguita utilizzando un kit commerciale per Real Time PCR (qPCR), con tre repliche biologiche e tecniche per campione. <ol><li> Per ogni reazione, preparare 17.67 ml di mix Real Time PCR (10 ml di PCR Master Mix + 7,67 ml di acqua priva di nucleasi), mescolare e mettere in ghiaccio. (ATTENZIONE: rischio chimico) </li><li> Aggiungere 1 ml, per ogni tubo di PCR, di 20x primer qPCR (ATTENZIONE: rischio chimico). </li><li> Mettere 18.67 ml di mix qPCR in ciascun pozzetto della piastra. </li><li> Aggiungere 1,33 ml di prodotto trascrizione inversa nel suo corrispondente a micropiastre. </li><li> Chiudere la piastra e girare esso (300 gx 5 sec). </li><li> Inserire la piastra in un sistema di Real Time PCR e iniziare la corsa con le seguenti condizioni di PCR: tenere a 95 ° C per 10 minuti; 40 cicli di 15 secondi a 95 ° C e 60 secondi a 60 ° C. Processo e normalizzare i dati secondo la formula 2 - ΔΔct 13. </li></ol>

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</ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Con questo protocollo combinato è stato possibile eseguire un&#39;analisi exosomal miRNA dal plasma di pazienti con NSCLC. Questi dati possono riflettere lo stato della malattia, ma questo deve essere confermato da ulteriori studi. Il protocollo utilizzato in questo articolo è basato su un kit commerciale per l&#39;isolamento exosome. La ragione è che le altre procedure di isolamento noto (ad es., La densità ultracentrifugazione gradiente) richiedono procedure più manuali, portando ...

Il basso tasso di sopravvivenza nel NSCLC (non a piccole cellule cancro ai polmoni) pazienti è dovuta principalmente alla limitata efficacia dei trattamenti di malattia avanzata e poveri diagnosi precoce 1. Mutazioni attivanti nel gene EGFR, che sono stati scoperti in una sottopopolazione di pazienti con NSCLC, sono noti per conferire sensibilità agli inibitori della tirosin-chinasi (TKI). Purtroppo, la maggior parte dei pazienti con NSCLC EGFR mutanti sviluppare una resistenza TKI 2. Soprattutto in questo contesto, una diagnosi corretta è obbligatoria. In generale, a causa della localizzazione dei tumori, l&#39;ottenimento di tessuto bioptico nel NSCLC non è sempre possibile. Pertanto, diversi studi sono in corso che utilizzano metodi non invasivi per ottenere questi dati biologici. Exosomes sono descritti come componenti biopsia liquidi che potrebbero essere studiati in modo da ottenere valori diagnostici e prognostici con tecniche non invasive 3. Esosomi sono nanovesicles (40 - 100 nm di diametro) di eorigine ndocytic che vengono rilasciati da diversi tipi di cellule, sia in condizioni fisiologiche e patologiche 4. Possono trasportare proteine, lipidi, mRNA e microRNA. Inoltre, diversi studi suggeriscono un ruolo pleiotropico di tumore derivato esosomi, che possono influenzare la crescita e la sopravvivenza delle cellule tumorali, l&#39;angiogenesi, stromale e rimodellamento della matrice extracellulare e la resistenza ai farmaci 5. I microRNA (miRNA) sono di breve RNA non codificanti che sono coinvolti nella regolazione post-trascrizionale, vincolante il 3&#39;-UTR dei mRNA bersaglio e che porta l&#39;mRNA di degrado o di un non-traduzione 6. Raccolta differenziata dei miRNA in esosomi è stato descritto. In questo contesto, recentemente è stato dimostrato, in vitro e in vivo, un imballaggio selettiva di miR-21 (un miRNA noto con effetti oncogeni) in esosomi rilasciati da linee cellulari leucemia mieloide cronica dopo il trattamento curcumina 7. Ilprofilo exosomal miRNA è simile al profilo miRNA del tumore primario e questa caratteristica può essere sfruttata nella diagnosi precoce e la prognosi 3. In particolare, vi è la possibilità di caratterizzare, mediante real-time PCR, miRNA selezionati correlate con il profilo molecolare della malattia, per esempio., Mutazioni EGFR tra gli altri 8. Qui, l&#39;analisi di un panel selezionato di NSCLC-correlato miRNA 8-9 è descritto che sono stati isolati da exosomes liberati nel sangue di pazienti con NSCLC. Dopo aver ottenuto il consenso informare rapporto dai pazienti, al plasma di 12 pazienti con NSCLC e 6 controlli sani, sono stati analizzati. L&#39;isolamento exosome è stata eseguita con kit commerciale secondo il protocollo del produttore. Prima isolamento exosome, campioni di plasma sono stati trattati con RNAsi, per degradare contaminanti circolanti miRNA. Abbiamo deciso di effettuare questa analisi con un kit commerciale a causa della standardizzazione limitato di altri Techniques (ad es., ultracentrifugazione) che è particolarmente importante quando si lavora con campioni clinici. Questo kit comprende un trattamento proteinasi K, che degradano la RNAsi, e diminuisce il rischio di degradare miRNA exosomal dopo exosome lisi. analisi microRNA è stata effettuata da Real Time-analisi sensibile e specifica PCR; mir-1228-3p è stato utilizzato come controllo endogeno ed i dati sono stati normalizzati in base alla formula 2 - ΔΔct. I valori di controllo sono utilizzati come riferimento e risultati sono riportati in scala logaritmica.

<table><tbody><tr><td>Kit di isolamento totale dell'esosoma (dal plasma)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>4484450</td><td>Uso Trattamento con proteinasi K</td></tr><tr><td>Ribonucleasi A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo ALIX (3A9)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2171S</td><td></td></tr><tr><td>TSG-101 Anticorpo (C-2)</td><td>SantaCruz Biotecnology</td><td>SC-7964&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo HRP 1 ml&nbsp; &nbsp;</td><td>Mini kit di segnalazione cellulare</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>RNAspin Illustra 50</td><td>GE HealthCare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa Taqman MicroRNA</td> Life <td>Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>002919</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30b TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>000602</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-30c TaqMan MicroRNA test</td><td>Life Technologies</td><td>000419</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-122 TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>002245</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-195 TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>000494</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-203 TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td>000507</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-103 TaqMan MicroRNA assay</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>000439</tr><tr><td>has-miR-221 TaqMan MicroRNA test</td><td>Life Technologies</td><td>000524</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-2222 TaqMan MicroRNA test</td><td>Life Technologies</td><td>002276</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td><td>Life Technologies</td><td>4440043</td><td></td></tr></tbody></table>

exosomal analisi mirna in non a piccole cellule del cancro del polmone (nsclc) dei pazienti plasma attraverso qpcr: un fattibile liquido biopsia strumento

Exosomal miRNA Analysis in Non-small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients' Plasma Through qPCR: A Feasible Liquid Biopsy Tool

La scoperta di alterazioni nei geni EGFR e ALK, tra gli altri, nel NSCLC ha guidato lo sviluppo di una terapia farmacologica mirata utilizzando inibitori selettivi della tirosin-chinasi (TKI). Per ottimizzare l'uso di questi TKI, è necessaria la scoperta di nuovi biomarcatori per la diagnosi precoce e la progressione della malattia. Questi esosomi isolati al plasma possono essere utilizzati come modo non invasivo e ripetibile per il rilevamento e il follow-up di questi biomarcatori. Come fonti di esosomi è stato utilizzato un ml di plasma di 12 pazienti con NSCLC, con diverse mutazioni e trattamenti (e 6 donatori sani come controlli). Dopo il trattamento con RNAsi, al fine di degradare i miRNA circolanti, gli esosomi sono stati isolati con un kit commerciale e risospesi in tamponi specifici per ulteriori analisi. Gli esosomi sono stati caratterizzati mediante western blotting per ALIX e TSG101 e mediante analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), le tecniche standard per ottenere dati biochimici e dimensionali di queste nanovescicole. L'estrazione dell'RNA totale è stata eseguita con un kit commerciale ad alto rendimento. A causa del contenuto limitato di miRNA negli esosomi, abbiamo deciso di eseguire la PCR retrotrascrizionale utilizzando un test individuale per ogni miRNA selezionato. Un pannello di miRNA (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), tutti correlati con la malattia da NSCLC, è stato analizzato sfruttando la notevole sensibilità e specificità dell'analisi Real-Time PCR; Il mir-1228-3p è stato utilizzato come controllo endogeno e i dati sono stati elaborati secondo la formula 2-ΔΔct 13. I valori di controllo sono stati utilizzati come base e i risultati sono mostrati in scala logaritmica.

Un totale di 12 nel plasma di pazienti con NSCLC e 6 controlli sani sono stati trattati con il kit commerciale per l&#39;isolamento exosome dal plasma. Ogni campione è stato elaborato da analisi Western Blot per valutare l&#39;marcatori exosomal ALIX (96 kDa) e Tsg101 (43 kDa). Un esempio di questi risultati sono presentati 3 campioni in figura 1, che indica che l&#39;isolamento exosome da campioni di plasma è fattibile con questo protocollo. <p class="jove_content" ...

Questo protocollo descrive la fattibilità di eseguire la profilazione dei miRNA negli esosomi, rilasciati nel plasma di pazienti con NSCLC, attraverso un kit commerciale di isolamento degli esosomi con trattamenti con proteinasi K e RNAsi, al fine di evitare la contaminazione dei miRNA circolanti e valutare le loro caratteristiche di biomarcatori nel NSCLC.

Exosomal Analisi miRNA in non a piccole cellule del cancro del polmone (NSCLC) dei pazienti plasma attraverso qPCR: Un fattibile Liquido biopsia Strumento

The discovery of alterations in the EGFR and ALK genes, amongst others, in NSCLC has driven the development of targeted-drug therapy using selective ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare gli esosomi presenti nel plasma di pazienti con NSCLC, liberi da fonti di microRNA non esosomiali come il microRNA circolante libero e la microRNAse, mediante un trattamento enzimatico doppio prima dell'isolamento degli esosomi. Questo metodo può facilitare l'analisi del microRNA nei prelievi lipidici tramite il compartimento degli esosomi, contribuendo a chiarirne l'utilizzo come biomarcatori. Il principale vantaggio di questa procedura è il trattamento enzimatico preliminare, che elimina le fonti non esosomiali di microRNA che potrebbero interferire con l'analisi.Per iniziare, scongelare un campione di plasma di un mL su ghiaccio. Una volta scongelato, capovolgere il tubo diverse volte per disgregare eventuali crioprecipitati formatisi. Successivamente, centrifugare il plasma a 2.000 G per 20 minuti a temperatura ambiente per rimuovere cellule e detriti.Recuperare il soprannatante e centrifugare nuovamente il plasma, questa volta a 10.000 G per 20 minuti. Recuperare di nuovo il soprannatante plasmatico e aggiungere 10 microlitri di RNasi. Incubare il plasma a 37 gradi Celsius per 10 minuti in un blocco termoregolato.Abbiamo aggiunto il passaggio di trattamento con RNasi al protocollo chiave standard al fine di degradare il micro RNAse libero. Successivamente, il passaggio di trattamento con proteinasi incluso nel protocollo chiave è stato sfruttato per degradare i saggi di RNA e proteggere l'integrità del micro RNAse esosomale. Trasferire quindi il plasma in un nuovo tubo, aggiungere un volume pari alla metà di PBS 1x ed eseguire un vortex.Quindi aggiungere 0,05 volumi di soluzione di proteinasi K, vortexare nuovamente il campione e incubarlo a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Aggiungere ora 0,2 volumi di tampone di precipitazione degli esosomi e mescolare il campione per inversione. Successivamente, incubare il campione a quattro gradi Celsius per 30 minuti.Dopo l'incubazione a freddo, centrifugare il campione a 10.000 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Prelevare un'aliquota di 20-50 microlitri del soprannatante e conservarla a scopo di controllo. Quindi aspirare e scartare il soprannatante rimanente.Risospendere il pellet di esosomi nel tampone scelto, in un volume dipendente dall'analisi successiva. Per l'analisi dell'RNA, aggiungere il tampone di lisi specifico per l'estrazione dell'RNA. Prima di iniziare, pulire l'area di lavoro e gli oggetti associati con i reagenti appropriati per garantire un ambiente privo di RNasi.Preparare la miscela maestra per la trascrizione inversa seguendo le istruzioni del fornitore. In questo esempio verranno processati due campioni. Per ogni campione, si preparano nove aliquote della miscela maestra da sette microlitri ciascuna, una per ciascun micro RNA selezionato.Conservare le provette su ghiaccio. Aggiungere ora cinque microlitri di soluzione di RNA esosomiale a ciascuna provetta, per una concentrazione totale di RNA di 10 microgrammi. Mescolare i campioni con pipettaggio delicato.Quindi aggiungere tre microlitri del primer di trascrizione inversa appropriato in ogni provetta della reazione e mescolare delicatamente i campioni mediante pipettaggio. Lasciarli incubare sul ghiaccio per cinque minuti prima di procedere. Ora le provette della reazione possono essere caricate nel termociclatore.Eseguire i cicli di reazione secondo le indicazioni del fornitore. In questa procedura, tutti i micro RNA devono essere testati in triplice copia per ogni paziente. Ciò include l'esecuzione di triplicati anche per i controlli negativi.Assicurarsi di includere almeno un micro RNA di riferimento per normalizzare correttamente i dati, poiché non esiste un consenso riguardo a micro RNA circolanti espressi in modo stabile. I micro RNA candidati ottenuti in precedenza possono essere utilizzati come riferimento. Iniziare preparando la miscela per la PCR.Preparare un mix per ogni microRNA che verrà valutato. Conservare i reagenti e i primer sul ghiaccio, protetti dalla luce, fino al momento dell'uso. Per ogni pozzetto della PCR, preparare un carico di 10 microlitri di mix master per la PCR.Con 7,67 mL di acqua priva di nucleasi e un microlitro di primer PCR, aumentare questi volumi in base al numero di pozzetti da riempire sulla piastra, aggiungendo un leggero eccesso. Ora aggiungere 18,67 microlitri delle miscele preparate nei corrispondenti pozzetti della piastra. Successivamente, aggiungere 1,33 microlitri del prodotto appropriato della reazione di trascrizione inversa nel pozzetto corrispondente della piastra, portando ciascun pozzetto a un volume finale di 20 microlitri.Per i pozzetti di controllo negativo, aggiungere 1,33 microlitri di acqua. Chiudere ora la piastra e centrifugarla in uno spinatore per piastre per alcuni secondi a 300 G. Utilizzando il software di PCR in tempo reale, assegnare i reporter nel modello, assegnare i geni bersaglio, definire i volumi di reazione e impostare i pozzetti dell'esperimento.Ora caricare la piastra in un termociclatore e definire i parametri della reazione secondo le specifiche del fornitore. Al termine della corsa, esportare i dati, inclusi i valori CT, in un foglio di calcolo per l'analisi. Dodici campioni di plasma da pazienti con NSCLC e sei controlli sani sono stati processati come descritto.I marcatori degli esosomi sono stati analizzati mediante Western Blot. I marcatori associati agli esosomi, ALIX e TSG101, erano presenti nei campioni. Per caratterizzare biopisicamente i campioni, è stata eseguita un'analisi mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).Si sono osservati vescicoli rotondeggianti con dimensioni comprese tra 40 e 100 nanometri. Otto microRNA, descritti come deregolati nel NSCLC da diversi modelli, sono stati analizzati mediante RTPCR. Il controllo interno mir-1228 è stato convalidato come controllo endogeno stabile in un diverso insieme di campioni.È stato riscontrato che i microRNA analizzati sono deregolati nei campioni clinici provenienti da pazienti con cancro del polmone rispetto ai controlli. Questo protocollo consente di analizzare i microRNA esosomiali presenti in campioni di plasma, evitando altri compartimenti che potrebbero interferire con l'analisi. Si raccomanda di utilizzare l’aliquota di supernatante conservata come controllo al fine di monitorare l’efficienza del trattamento enzimatico.Le biopsie liquide sono molto importanti nel cancro, in particolare nel cancro del polmone, poiché diverse componenti come le CTC o il DNA libero vengono utilizzate non solo oggi, ma anche per il follow-up dei pazienti. Gli esosomi rappresentano la nuova componente di queste biopsie liquide, con importanti attività pleiotropiche. Una di queste, ad esempio, è la resistenza diretta.Invito a vedere questo video per selezionare e caratterizzare i vostri esosomi nel vostro laboratorio. Grazie per aver guardato.

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