Exosomal Analisi miRNA in non a piccole cellule del cancro del polmone (NSCLC) dei pazienti plasma attraverso qPCR: Un fattibile Liquido biopsia Strumento

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare gli esosomi presenti nel plasma di pazienti con NSCLC che sono privi di fonti di micro RNA non esosomiali come la micro RNAsi circolante libera utilizzando un doppio trattamento enzimatico prima dell'isolamento dell'esosoma. Questo metodo può aiutare l'analisi delle biopsie lipidiche di micro RNA nel compartimento esosomiale che aiuterà a chiarire il loro uso come biomarcatori. Il vantaggio principale di questa procedura è il pretrattamento enzimatico che elimina le fonti non esosomiali di micro RNA che potrebbero interferire con l'analisi.

Per iniziare, scongelare un campione di plasma da un ml su ghiaccio. Una volta scongelato, capovolgere il tubo più volte per disaggregare eventuali crioprecipitati che potrebbero essersi formati. Quindi centrifugare il plasma a 2.000 G per 20 minuti a temperatura ambiente per rimuovere cellule e detriti.

Raccogliere il surnatante e centrifugare nuovamente il plasma, ora a 10.000 G per 20 minuti. Raccogli di nuovo il surnatante al plasma e ora aggiungi 10 microlitri di RNasi. Incubare il plasma a 37 gradi Celsius per 10 minuti in un riscaldatore a termoblocco.

Abbiamo aggiunto la fase di trattamento con RNasi al protocollo chiave standard per degradare il micro RNAsi libero. Successivamente, è stata sfruttata la fase chiave del trattamento della proteinasi, incluso il protocollo chiave, al fine di degradare i saggi di RNA e proteggere l'integrità del micro RNAsi esosomiale. Quindi trasferisci il plasma in un nuovo tubo, aggiungi mezzo volume di 1x PBS e agitalo.

Quindi aggiungere 0,05 volumi di soluzione di caso di proteinasi e incubare nuovamente il campione a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Ora aggiungere 0,2 volumi di tampone di precipitazione dell'esosoma e mescolare il campione per inversione. Quindi incubare il campione a quattro gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo l'incubazione a freddo, centrifugare il campione a 10.000 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Prelevare un'aliquota da 20 a 50 microlitri del surnatante e conservarla a scopo di controllo. Quindi aspirare e scartare il surnatante rimanente.

Risospendere il pellet di esosoma nel tampone di scelta a un volume che dipende dall'analisi a valle. Per l'analisi dell'RNA aggiungere un tampone di lisi specifico per l'estrazione dell'RNA. Prima di iniziare, pulire l'area di lavoro e gli elementi associati con i reagenti appropriati per garantire un ambiente privo di RNAsi.

Prepara il tuo master mix di trascrizione inversa secondo le istruzioni dei fornitori. In questo esempio verranno elaborati due campioni. Per ogni campione vengono preparate nove aliquote master mix da sette microlitri, una per ogni micro RNA selezionato.

Conservare i tubi di reazione sul ghiaccio. Ora aggiungi cinque microlitri di soluzione di RNA esosomiale a ciascuna provetta di reazione con una concentrazione totale di RNA di 10 microgrammi. Miscelare i campioni con un pipettaggio delicato.

Quindi aggiungere tre microlitri del primer per trascrizione inversa appropriato a ciascuna provetta di reazione e mescolare delicatamente i campioni con il pipettaggio. Lasciateli incubare sul ghiaccio per cinque minuti prima di procedere. Ora le provette di reazione possono essere caricate nel termociclatore.

Eseguire i cicli di reazione in base alle esigenze dei fornitori. In questa procedura tutte le micro RNAsi devono essere testate in triplicato per ogni paziente. Ciò include l'esecuzione di triplicati per i controlli negativi.

Assicurati di includere almeno un micro RNA di riferimento per normalizzare correttamente i dati, poiché non esiste consenso per i micro RNAsi circolanti espressi in modo stabile. Il micro RNAsi candidato ottenuto in precedenza può essere utilizzato come riferimento. Inizia con la preparazione della miscela PCR.

Prepara una miscela per ogni micro RNA che verrà valutato. Conservare i reagenti e i primer su ghiaccio al riparo dalla luce fino al momento dell'utilizzo. Per ogni pozzetto di PCR preparare a caricare 10 microlitri di PCR master mix.

Con 7,67 ml di acqua priva di nucleasi e un microlitro di primer PCR, aumentare questi volumi fino al numero di pozzetti necessari per riempire la piastra con un piccolo extra. Caricare ora 18,67 microlitri delle miscele preparate nei pozzetti della piastra corrispondenti. Quindi aggiungere 1,33 microlitri del prodotto appropriato per la reazione di trascrizione inversa nel pozzetto della piastra appropriato, riempiendo ogni pozzetto a 20 microlitri.

Per i pozzetti di controllo negativo aggiungere 1,33 microlitri di acqua. Ora chiudete la piastra e centrifugatela in una centrifuga per qualche secondo a 300 G. Utilizzando il software di PCR in tempo reale nel modello, assegna i reporter, assegna i geni target, definisce i volumi di reazione e imposta i pozzetti dell'esperimento.

Caricare ora la piastra in un termociclatore e definire i parametri di reazione secondo le specifiche del fornitore. Una volta completata la corsa, esporta i dati, inclusi i valori CT, in un foglio di calcolo per l'analisi. Dodici campioni di plasma di pazienti con NSCLC e sei controlli sani sono stati processati come descritto.

I marcatori degli esosomi sono stati analizzati mediante Western Blot. I marcatori legati agli esosomi, ALIX e TSG101 erano presenti nei campioni. Per caratterizzare biofisicamente i campioni è stata eseguita l'analisi TEM.

Sono state trovate vescicole rotonde che vanno da 40 a 100 nanometri. Otto micro RNA, descritti come deregolati nel NSCLC da vari modelli, sono stati analizzati utilizzando RTPCR. Il controllo interno mir 1228 è stato convalidato come controllo endogeno stabile in un diverso set di campioni.

È stato riscontrato che i micro RNA analizzati sono deregolati nei campioni clinici dei pazienti con cancro al polmone rispetto ai controlli. Questo protocollo consente di analizzare i micro RNAsi correlati all'esosomiale da campioni di plasma, evitando altri compartimenti che potrebbero interferire con l'analisi. Si consiglia di utilizzare l'aliquota surnatante conservata come controllo per monitorare l'efficienza del trattamento enzimatico.

Le biopsie liquide sono molto importanti nel cancro, in particolare nel cancro del polmone perché molti dei componenti come il CTC o il DNA libero vengono utilizzati non solo oggi, ma anche per il follow-up con i pazienti. Gli esosomi sono il nuovo componente di queste biopsie liquide con importanti attività pleotropiche. Uno di questi, ad esempio, è la resistenza diretta.

Vi invito a vedere questo video per selezionare e caratterizzare i vostri esosomi nel vostro laboratorio. Grazie per aver guardato.