Name: Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Impara l'isolamento, la coltura e la trasduzione di cardiomiociti di topo adulto con elevata resa e vitalità. Questo metodo supporta la ricerca cardiovascolare e lo studio del ciclo cellulare.

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Questo progetto è stato finanziato dal Programma UCSF per Breakthrough Ricerca Biomedica (finanziato in parte dalla Fondazione Sandler), il NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738), e la Fondazione Edward Mallinckrodt Jr.. JJ è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dal NIH (T32HL007731). Gli autori sono gli unici responsabili del contenuto di questo lavoro, che non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del NIH.

Tutte le procedure descritte qui sono stati approvati dalla Utilizzo e manutenzione Comitato istituzionale degli animali presso l&#39;Università della California, San Francisco. NOTA: Brevemente, dopo estrazione cuore dal torace mouse, coronarica perfusione retrograda viene utilizzato per digerire efficientemente la matrice extracellulare con collagenasi e proteasi XIV. I ventricoli sono poi isolate, dissociato meccanicamente e filtrati in una sospensione di cellule singole. Gravità sedimentazione viene eseguita per isolare cardiomiociti, che sono separati da cellule stromali come fibroblasti e cellule endoteliali da loro alta densità. I cardiomiociti purificati possono essere coltivate per settimane su polistirolo laminina rivestite e trasdotte con vettori genici adenovirus. Isolamento 1. Cardiomyocyte <ol><li> Preparare Buffer, Stazione chirurgica e perfusione Apparatus <ol><li> Preparare buffer e dei media in base alla TabLe 1. </li><li> Accendere bagno di acqua circolante, impostare la temperatura di ingresso in modo che l&#39;uscita della camicia d&#39;acqua riscaldata raggiunge una temperatura di 37 ° C. </li><li> sistema di perfusione pulito da vampate di calore con il 70% di etanolo. Quindi rimuovere tutte le tracce di etanolo dal sistema mediante flussaggio con diversi volumi di acqua sterile. </li><li> Caricare il sistema di perfusione con tampone perfusione (Tabella 1). acqua in primo luogo di scarico dal sistema, poi sciacquare con 2 volumi di tampone perfusione. Poi riempire lo spazio morto con tampone perfusione tale che la colonna interna della giacca di calore è riempita con tampone perfusione, ma la camera debubbling è vuoto. SUGGERIMENTO: Assicurarsi che non ci siano bolle d&#39;aria presenti nella riga sotto la camera debubbling. Per rimuovere le bolle recalcitranti, coinvolgere tutti i rubinetti e permettere la pressione per costruire all&#39;interno della linea per alcuni secondi. Quindi rilasciare il rubinetto inferiore, consentendo il buffer di perfusione ad alta pressione del getto dalla presa; il rapido flusso e Turbulence contribuirà a sloggiare le bolle che vengono catturati vicino alla presa di perfusione. </li><li> Preparare una siringa con ago da utilizzare per incannulazione aortica. Collegare un ago smussato 18 G per una siringa da 1 ml riempita con tampone di perfusione. Rimuovere le bolle d&#39;aria e fissare il gruppo siringa per un braccio dell&#39;illuminatore dissezione miscroscope con nastro laboratorio. SUGGERIMENTO: per creare un ago ended smussato da un ago smussato, transetto l&#39;albero ago con tronchese. Poi affinare la punta con una pietra levigatura fino a quando la punta è piatta. NOTA: per ridurre lo slittamento dell&#39;aorta dall&#39;ago durante incannulazione, irruvidire l&#39;albero dell&#39;ago incannulazione usando una lama di rasoio. Fissare l&#39;ago dal mozzo e albero superiore, poi vide il rasoio e indietro perpendicolarmente all&#39;asse lungo dell&#39;albero dell&#39;ago durante la rotazione fino a diversi solchi ricavati da 1 cm dalla punta dell&#39;albero dell&#39;ago. Passare a un nuovo rasoio quando la lama diventa opaco. </li><li> Posizionare un pulitopetri piatto sotto il microscopio da dissezione per contenere il cuore durante l&#39;incannulamento. Posizionare il braccio illuminatore tale che la punta della cannula è vicino al bordo del campo visivo, ma non ostacolare la dissezione. Assicurarsi che la punta della cannula è sotto il bordo della capsula di Petri. NOTA: Per aiutare immobilizzare il cuore durante la dissezione, posizionare un piccolo (~ 5 - 7 cm 2) quadrato di 215 micron di maglia nella capsula di Petri. Quando il cuore è posto su questa rete, creerà attrito per ridurre scorrimento e rotazione del cuore durante manipolazione meccanica. </li><li> Tie 2 punti di sutura con sciolti nodo semplice doppio intorno al fulcro della cannula da utilizzare per il fissaggio della aorta. </li></ol></li><li> Cuore Estrazione e Incannulamento <ol><li> Somministrare eparina (5 UI / g di peso corporeo) mediante iniezione intraperitoneale. Attendere 20 minuti per permettere l&#39;eparina di circolare al cuore. </li><li> Anestetizzare il mouse per iniettare intraperitonealeione del 20% carbammato di etile (2 mg etil carbammato / g di peso corporeo). Osservare da vicino fino a quando il mouse è sotto anestesia profonda (circa 3 - 5 minuti). NOTA: l&#39;anestesia profonda è confermata da una mancanza di entrambi pizzico punta e riflessi corneali. Se il mouse non ha raggiunto l&#39;anestesia profonda da 8 - 10 min, quindi somministrare una dose aggiuntiva di carbammato di etile. Anche se le risposte individuali all&#39;anestesia varieranno tra i topi, il fallimento di entrare in profondità dell&#39;anestesia alla prima somministrazione può indicare carbammato di etile degradato, che può precludere l&#39;anestesia profondi anche dopo somministrazioni ripetute. Per evitare il degrado, preparare una soluzione fresca di carbammato di etile prima di ogni utilizzo. </li><li> Immobilizzare il mouse per la piattaforma di chirurgia, garantendo ogni arto con del nastro adesivo chirurgico. Disinfettare la zona incisione con una quantità generosa di 70% di etanolo. Pat asciugare con un laboratorio-wipe. </li><li> Sollevare la pelle con una pinza di tessuto appena sotto lo sterno. Effettuare una incisione laterale con piccole forbici, tagliando through la pelle e l&#39;addome. </li><li> Utilizzare hemostats per sollevare delicatamente la gabbia toracica tramite lo sterno. Utilizzando piccole forbici dissezione, estendere l&#39;incisione in una forma a V verso l&#39;ascelle. Tagliare prima nervatura e perforare la membrana su ogni lato. </li><li> Continuare a sollevare la cassa toracica con hemostats e utilizzare piccole forbici iris al transetto completamente il diaframma. Fare attenzione a non forare il cuore. </li><li> Ritrarre la gabbia toracica rostralmente utilizzando emostatiche annessi e rapidamente, ma si estendono attentamente l&#39;incisione a forma di V, tagliando attraverso la gabbia toracica verso il ascelle su entrambi i lati. Ritrarre la sezione centrale della cassa toracica completamente e fissare le pinze emostatiche collegati a tenere in posizione. </li><li> Rimuovere il pericardio utilizzando una pinza sottile. </li><li> Mentre delicatamente sollevare il cuore con pinze curve, transetto le vene e le arterie collegate al cuore. Subito posizionare cuore in tampone perfusione ghiacciata per rallentare la contrazione muscolare. </li><li> Mettere il cuore in una capsula di Petri sottoun microscopio dissezione (posto su un piccolo pezzo di 215 micron di maglia per aiutare immobilizzare durante la dissezione). Trim qualsiasi tessuto non-cardiaca in eccesso con iris belle forbici. Fare attenzione durante il taglio in prossimità dell&#39;aorta. </li><li> Transetto l&#39;aorta vicino l&#39;arteria brachioencephalic, e fare attenzione a non lasciare bolle o frammenti di tessuto entrano l&#39;apertura. </li><li> Riempire la capsula di Petri contenente cuore con tampone di ghiaccio freddo perfusione tale che il livello del liquido sale sopra l&#39;apertura della cannula. Guaina l&#39;aorta sulla cannula tale che la punta è appena distale alla valvola aortica. TIP: Per ridurre il rischio di embolia di aria, leggermente deprimere la siringa sulla cannula prima cannulazione per rimuovere le bolle d&#39;aria potenziali che possono essere sviluppati alla fine della cannula. Inoltre, mantenere la punta della cannula e l&#39;aorta sotto la superficie della soluzione per evitare l&#39;introduzione di bolle mentre guaina dell&#39;aorta. </li><li> Infilare un pre-legato 7-0 seta sutura giùl&#39;albero dell&#39;ago cannulazione e la posizione appena sopra la punta dell&#39;ago. Stringere il nodo con una pinza sottile. Ripetere questa operazione con un secondo di sutura posto appena sopra il primo. NOTA: Assicurarsi che la punta dell&#39;ago è ancora sopra la valvola aortica prima e dopo il serraggio. </li><li> Premere lentamente la siringa per espellere 0,5 ml di tampone perfusione attraverso il sistema vascolare coronarico. NOTA: Se la cannulazione ha avuto successo, il sangue sarà visualizzata lasciando il sistema vascolare coronarica e mettere in comune fuori delle vene dorsali e le arterie. IMPORTANTE: Il tempo di apertura della cavità toracica (in particolare, perforando la membrana) a siglare la perfusione deve essere ridotto al minimo per ridurre l&#39;esposizione ipossico e massimizzare la sopravvivenza e la salute dei cardiomiociti isolati. Idealmente, questa volta deve essere inferiore a 5 min. </li></ol></li><li> perfusione NOTA: La perfusione retrogradaapparecchiatura può essere convenientemente utilizzato in un ambiente pulito su un banco di laboratorio standard o collocato in una cappa a flusso laminare per massimizzare la sterilità. Tuttavia, dopo perfusione è completa, il lavoro deve essere eseguito sotto flusso laminare per minimizzare la contaminazione. <ol><li> Delicatamente ma con fermezza rimuovere l&#39;hub della cannula dalla siringa (usando guanti sterili) ruotando lentamente avanti e indietro. Tirando l&#39;ago cannulazione fuori della siringa, espellere lentamente buffer di perfusione nel mozzo dell&#39;ago per evitare bolle d&#39;aria durante la perfusione. </li><li> Rimuovere il tubo di ricircolo pescato da sotto la porta di uscita perfusione e sostituirlo con un bicchiere cattura dei rifiuti. Fissare il mozzo ago all&#39;adattatore luer che viene fissato alla porta di uscita di perfusione (figure 1, 2) sulla camicia d&#39;acqua, mentre la pompa è in esecuzione al livello più basso (15 giri, ~ 6 ml / min). SUGGERIMENTO: Quando si collega l&#39;hub ago all&#39;adattatore luer, permettono il buffer di perfusione stillicidio di ConNECT al liquido nel mozzo dell&#39;ago per evitare di introdurre bolle. </li><li> Profumato cuore senza ricircolo fino a 8 ml di tampone perfusione sono stati aspirati dal tubo di alimentazione. NOTA: Il volume di tampone perfusione aspirata dal tubo di alimentazione in questa fase assume un volume morto di 7 ml per il sistema di perfusione, per un totale di 15 ml di tampone perfusione pompato attraverso il cuore. </li><li> Rimuovere il tubo di ingresso dal buffer di perfusione. aria Lasciare essere aspirata dal ingresso per meno del volume morto del sistema. NOTA: Il volume di aria aspirata in questa fase deve essere regolata per evitare che l&#39;aria entri nel sistema vascolare coronarico (vedere il punto 1.3.7). </li><li> Posizionare il tubo di ingresso nel buffer di digestione (Tabella 1), appena sopra il fondo della provetta. Alimentano lentamente e permettere al tubo di ingresso per aspirare un volume sufficiente per evitare di riempire eccessivamente il tubo. </li><li> Visualizzare e seguire la bolla d&#39;aria tra ilil buffer di perfusione e il buffer di digestione mentre viaggia attraverso la camicia di calore. Osservare il livello di tampone di perfusione nel centro della giacca di calore iniziano a cadere una volta che la bolla d&#39;aria raggiunge la camera de-gorgogliamento. Quando il buffer di digestione raggiunge la camera de-gorgogliare, il livello del liquido nel rivestimento termico rimane costante. IMPORTANTE: Se il livello di buffer di perfusione scende troppo, chiudere il rubinetto di uscita e aprire il rubinetto di sfiato. Lasciare che il livello a salire ad un livello confortevole (3 - 5 pollici sopra la porta di uscita). Poi, fermare la pompa di perfusione e chiudere il rubinetto di sfiato. Aprire il rubinetto porta di uscita e riavviare la pompa di perfusione. </li><li> Vedere la soluzione che emerge dal cuore. Come ultimo del buffer di perfusione lascia il cuore e il buffer di digestione inizia circola attraverso il cuore, cambiamento di colore da chiaro a marrone chiaro sarà osservato per la presenza di collagenasi. </li><li> Profumato cuore con il tampone di digestionecirca il 10 - 15 min. Il cuore inizierà dinoccolato come il collagene è degradato e perde il supporto meccanico. </li></ol></li><li> La dissociazione meccanica e purificazione <ol><li> Rimuovere il cuore dalla cannula con una pinza e posto in una capsula di Petri a secco. tagliare rapidamente il tessuto extra-ventricolare con iris belle forbici. Trasferire i ventricoli di un piatto contenente tampone fresco petri perfusione da lavare. Spostare la capsula di Petri ad una cappa sterile e trasferire i ventricoli per un fresco, capsula di Petri a secco. </li><li> Raccogliere 7,5 ml di tampone di digestione dalla giacca fuoco e aggiungere 2,8 ml di 1 M CaCl 2, mescolare per inversione. Aggiungere 2 - 3 ml di tampone di digestione con CaCl 2 ai ventricoli nella capsula di Petri. NOTA: La concentrazione di Ca 2+ è sollevata da 300 a 700 micron </li><li> Triturare rapidamente il tessuto ventricolare con pinza sottile, in modo che la maggior parte pezzi sono inferiori a 1 mm 3. Aggiungere la rimangonoing buffer di digestione Ca 2+ integrato dal punto 1.3.2 ai ventricoli dissociate nella capsula di Petri e mescolare delicatamente agitazione. </li><li> Collocare la capsula di Petri in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2. Agitare la capsula di Petri ogni 2 minuti fino a quando cardiomiociti sufficienti (vedi nota sotto) sono stati rilasciati dal tessuto. NOTA: la lunghezza di incubazione può essere necessario regolare per calibrare il grado di digestione secondo le esigenze dell&#39;esperimento. In generale, tempi di incubazione più lunghi aumentare la resa e la purezza, ma può ridurre il tasso di adesione cellulare e la sopravvivenza. 5 - 10 min è generalmente sufficiente per ottenere un alto rendimento (~ 5 - 10 x 10 5 cellule per cuore). </li><li> Trasferire la capsula di Petri di nuovo ad una cappa a flusso laminare. Usando una pipetta di trasferimento tagliato a un angolo di 45 °, delicatamente pipetta il tessuto a dissociarsi ulteriormente. </li><li> Utilizzare guanti sterili per piegare la maglia 215 micron in un cono e rinviare un conica da 50 ml. Pipettala sospensione tessuto dissociato sulla maglia e consentire il filtrato affluisca nella conica 50 ml. Utilizzare 7,5 ml di tampone di arresto pre-riscaldato (Tabella 1) per lavare i cardiomiociti dalla capsula di Petri attraverso le maglie, combinandosi con il primo filtrato. NOTA: Ca 2+ è portata alla finale 1.1 mM e la finale FBS 2,5% nel buffer fermata neutralizza l&#39;attività della proteasi. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare ad una conica 15 ml e lasciar riposare per gravità per 15 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta di trasferimento in modo che solo 50 - 100 ml di soluzione rimane al di sopra delle celle. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato, terreni di coltura equilibrato (Tabella 1) e mescolare delicatamente per inversione. Lasciare le cardiomiociti di stabilirsi per gravità per 15 min. SUGGERIMENTO: Per aumentare la purezza, ripetere il punto 1.4.8 come desiderato. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta di trasferimento tale che solo 50 - 100 ml osoluzione f resterà sulle cellule. </li></ol></li></ol> 2. Cultura Cardiomyocyte <ol><li> Pre-coat tessuto cultura trattati piastre di Petri con laminina (10 mg / ml) e conservare a 37 ° C per 2 ore prima di placcatura cellule. Appena prima di placcatura, aspirare la soluzione laminina dalla piastra di coltura tissutale. Lavare una volta con MEM o PBS, quindi aspirare il liquido residuo per rimuovere laminina non assorbito. </li><li> Aggiungere abbastanza pre-riscaldato, terreni di coltura equilibrato per ottenere la densità cellulare desiderato, mescolare delicatamente per inversione. Piatto desiderata concentrazione di cellule nel recipiente di coltura (tipicamente 5 - 20 x 10 4 cellule / cm 2). Per valutare la resa di isolamento cardiomiociti, contare le cellule tramite emocitometro o test-plate controllando la densità al microscopio. Un cuore di topo adulto fornisce tipicamente 0,5 - 1,0 x 10 6 cellule in questa fase del protocollo. SUGGERIMENTO: Se si utilizza piastre a 96 pozzetti, utilizzare un micropip 1.000 mlette con una punta tagliata ad un angolo di 45 ° per ridurre al minimo i danni delle cellule a causa della forza di taglio. Posizionare la punta della pipetta tale che tocchi il fondo del pozzo durante l&#39;espulsione di sospensione cellulare in modo da minimizzare l&#39;introduzione di bolle. </li><li> Spostare il piatto di coltura cellulare prontamente a un 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 e il 95% di umidità. Cambiare media come necessario per impedire l&#39;acidificazione: ogni 1 - 5 giorni a seconda della densità cellulare. Minimizzare la manipolazione del piatto cultura durante i primi 3 - 6 giorni per facilitare il fissaggio su una superficie di coltura cellulare. NOTA: Per ridurre al minimo disturbo delle cellule durante i cambiamenti dei media quando le cellule non hanno pienamente attaccato, effettuare un cambio semi-media. Lentamente aspirare il supporto mantenendo la punta della pipetta appena sotto la superficie del supporto. Quindi aggiungere lentamente ulteriore supporto, mantenendo la punta della pipetta appena sopra la superficie del supporto contro la parete del piatto cultura. </li><li> Per valutare la fattibilità di cardiomiociti, controllarela morfologia al microscopio campo chiaro. Appena cardiomiociti isolati mantengono una morfologia più o meno a forma di asta con taglienti, bordi distinti sotto illuminazione campo chiaro (Figura 2). NOTA: Confermare la vitalità colorando le cellule con trypan blu. </li><li> Per valutare la purezza del isolamento cardiomiociti, controllare la morfologia delle cellule per identificare i cardiomiociti. Colorare i nuclei con Hoescht 33342 per identificare le cellule totali. NOTA: cardiomiociti possono essere identificati dai non cardiomiociti dalla loro morfologia caratteristica (rod-shaped) e dimensione (circa 100 - 200 micron di lunghezza). In alternativa, cardiomiociti isolati appena si macchia positivo per i marcatori specifici cardiomiociti, come alfa-actinina 26 (Figura 3C, D) o troponina cardiaca T. 27 </li></ol> 3. trasduzione genica con Adenovirus <ol><li> Preparare adenovirus lisato cellulare utilizzando stabilito metodi. 21 trasdurre i cardiomiociti utilizzando lisato cellulare da cellule produttrici adenovirus 10. Il giorno 0 o 1 giorno dopo l&#39;isolamento, aggiungere con cautela il lisato cellulare ai media che contiene i cardiomiociti. NOTA: Una preparazione adenovirus alto titolo raggiungerà forte espressione in circa 48-72 ore. Regolare la molteplicità di infezione per soddisfare il disegno sperimentale. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La salute generale dei cardiomiociti isolati dipende da diversi aspetti importanti di questo protocollo. In primo luogo, il tempo dall&#39;estrazione cuore a perfusione è critica e deve essere eseguita in 5 minuti o meno. La rimozione di calcio aiuta a dissociarsi interazioni cellula-cellula, ma può avere un impatto negativo sulla salute delle cellule a lungo termine. 29-32 Così, troviamo sufficiente per rimuovere il calcio durante i primi pochi minuti di perfusione di EGTA (acido tetraacetico glicole etileni...

Cardiomiociti in coltura sono spesso utilizzati per monitorare il comportamento delle cellule in un ambiente ben controllato in vitro. Ad esempio, le proprietà delle cellule morfologiche, elettriche, biochimici, o meccanici possono essere studiati su substrati ingegnerizzati, 1,2 in mezzi definiti, e in risposta ai farmaci piccole molecole, peptidi, regolazione genica, 3 o stimolazione elettrica. 4 Il contenuto cellulare può anche essere controllato tramite definiti co-culture. 5 Questi esperimenti in vitro sono utili per grandi schermi di droga o genetiche e si completano a metodi in vivo per i vari tipi di indagini che coinvolgono la biologia dei cardiomiociti. cultura a lungo termine consente viali sperimentali che richiedono estese periodi di tempo per realizzare il cambiamento fenotipico. Un esempio attuale è quello di adulto la proliferazione dei cardiomiociti dei mammiferi, in cui de-differenziazione, del ciclo cellulare di rientro, e la divisione cellulare è tipicamente studiati su ségiorni veral o settimane. 6,7 Qui, il tempo di cultura estesa facilita la manipolazione genetica, 7,8 de-differenziazione funzionale (ad esempio, lo smontaggio sarcomerica) 9 e de-differenziazione potenzialmente trascrizionale. 6 successiva del ciclo cellulare di rientro e la divisione cellulare richiede periodi di cultura ancora più lunghi per osservare, soprattutto se più cicli di divisione sono l&#39;obiettivo sperimentale. L&#39;importanza del ciclo cellulare cardiomiociti è centrale per molti chiave recenti lavori scientifici nella rigenerazione del cuore, dove è stato dimostrato responsabile per la rigenerazione cardiaca in zebrafish e topi neonatali il dedifferentiation e la proliferazione dei cardiomiociti preesistenti. 10-12 Così, la possibilità per stimolare dedifferentiation e del ciclo cellulare rientro in cardiomiociti adulti mammiferi rimane una questione chiave nella rigenerazione cuore umano 13-15 I n esperimenti in vitro che studiano il ciclo cellulare dei mammiferi cardiomiociti sono prevalentemente utilizzati fonti ratto, grazie alla loro relativa facilità di coltura a lungo termine rispetto ai modelli di topo. 16 Tuttavia, sistemi murini offrono una ricca fonte di strumenti transgenici ben caratterizzati e modelli di malattia che sono utili sia in vitro che in vivo protocolli. Ad esempio, lineage tracing Cre-based ha permesso l&#39;identificazione di cardiomiociti preesistenti come fonte di rigenerare miocardio nel cuore neonatale topo in vivo. 12 Studi in vitro su cardiomiociti di topo neonatali lineage tracing hanno permesso l&#39;esame delle interazioni con stromale cellule attraverso co-coltura con fibroblasti. 5 Tuttavia, a causa delle sue sfide, 17 pochi rapporti esistono di isolamento e di lungo periodo della cultura di cardiomiociti di topo adulto. 18,19 L&#39;isolamento di vitali cardiomiociti di topo adulto per la cultura a breve termine da solo è conosciuto per essere un compito impegnativo. Questo ProtoColo fornisce istruzioni passo-passo su come raggiungere cardiomiociti vitali da topi adulti che possono essere utilizzati sia per il breve termine, così come le indagini a lungo termine. Cardiomiociti isolati utilizzando questo protocollo possono essere efficacemente trasdotte con vettori adenovirali 20,21 e coltivate per settimane. Questi metodi forniscono un potente sistema per studiare la biologia dei cardiomiociti in vitro. I metodi descritti nel presente documento si basano su diversi elementi da opere precedenti utilizzando varianti della perfusione retrograda Langendorff. 18,22 Sebbene diversi protocolli sono stati pubblicati sulla isolamento di cardiomiociti di topo adulto per la cultura a breve termine e di studio, 23-25 ​​il vantaggio di questo protocollo è la capacità di cultura isolate cardiomiociti a lungo termine. Questo sarà utile nello studio dei processi cellulari in cui l&#39;espressione genica ectopica e richiedono lunghi periodi di tempo, come nelle strategie riprogrammazione cellulare.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camicia d'acqua riscaldata</td><td>Radnoti</td><td>158831</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua riscaldato circolante, Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013</td><td></td></tr><tr><td>Pompa da laboratorio</td><td>Watson-Marlow</td><td>323</td><td></td></tr><tr><td>Emostatici</td><td>Exelta</td><td>63042-090</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tessuti</td><td>VWR</td><td></td><td></td>470128034</tr><tr><td>Dumont #7 pinza curva</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinza fine</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione piccole</td><td>VWR</td><td>470128034</td><td></td></tr><tr><td>Forbici bonn extra fini</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla fine</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Nome</ strong</td><td>>Azienda</td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2 O</td><td></td><td>Fisher S25837</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Fisher</td><td>S25414</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>86329</td><td></td></tr><tr><td>Butano dione monoxime (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>BP310100</tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Novo Nordisk</td><td>393153</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Amresco</td><td>0732-288</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi, tipo XIV</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS, inattivato a caldo</td><td>JRS</td><td>43613</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invitrogen</td><td>NC9141851</td><td></td></tr><tr><td>Carbammato di etile</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA44804-18</td><td></td></tr><tr><td>maglia da 215 micron</td><td>Fornitura di componenti</td><td>U-CMN-215-A</td><td></td></tr><tr><td>20 G ago smussato</td><td>Becton Dickinson</td><td>305183</td><td></td></tr><tr><td>20 G ago smussato</td><td>Becton Dickinson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Nastro da laboratorio</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr><tr><td>Nastro chirurgico</td><td>3M</td><td>1527-0</td><td></td></tr><tr><td>Sutura di seta, 7-0</td><td>Teleflex</td><td>15B051000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-alfa-actinina di topo</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo IgG1 anti-topo di capra</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21121</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cardiomiociti in coltura possono essere utilizzati per studiare la biologia dei cardiomiociti utilizzando tecniche che sono complementari ai sistemi in vivo. Ad esempio, la purezza e l&#39;accessibilità della cultura in vitro consente un controllo preciso analisi biochimiche, immagini dal vivo, e elettrofisiologia. cultura a lungo termine di cardiomiociti offre l&#39;accesso ad approcci sperimentali aggiuntivi che non possono essere completate in colture a breve termine. Ad esempio, l&#39;indagine in vitro di dedifferentiation, ciclo cellulare di rientro, e la divisione cellulare è finora stato in gran parte limitato a cardiomiociti di ratto, che sembrano essere più robusto nella cultura a lungo termine. Tuttavia, la disponibilità di un ricco set di strumenti di linee di topi transgenici e modelli di malattia ben sviluppati rendere i sistemi di mouse attrattivo per la ricerca cardiaca. Anche se diversi rapporti esistano di topo adulto isolamento dei cardiomiociti, alcuni studi dimostrano la loro cultura a lungo termine. Presentato qui, è un metodo step-by-step per laisolamento e di lungo periodo della cultura di cardiomiociti di topo adulto. Innanzitutto, retrograda perfusione Langendorff è usato per digerire efficientemente il cuore con proteasi, seguita da purificazione gravità sedimentazione. Dopo un periodo di de-differenziazione seguito isolamento, le cellule gradualmente attribuiscono alla cultura e possono essere coltivate per settimane. Adenovirus lisato cellulare viene utilizzato per trasdurre efficientemente i cardiomiociti isolati. Questi metodi forniscono un semplice, ma potente sistema modello per studiare la biologia cardiaco.

Un tipo adulto selvaggio ICR (CD1) cuore del mouse produce tipicamente 500.000 a 1 milione di cardiomiociti da un isolamento di successo. Subito dopo l&#39;isolamento, le cellule mantengono un aspetto prevalentemente a forma di asta (Figura 3A) con sarcomeri intatti e possono essere utilizzati per studi funzionali coinvolgono cardiomiociti contrattilità. Una percentuale elevata di cardiomiociti astiformi (superiori al 90%) è indice di perfusione efficace e la digestione....

Questo protocollo descrive un metodo passo-passo per l'isolamento riproducibile e la coltura a lungo termine di cardiomiociti di topo adulto con alta resa, purezza e vitalità.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cardiomiociti primari vitali da topi adulti per la coltura e la trasduzione con vettori adenovirali. Questo metodo risponderà ad alcune delle domande fondamentali nel campo della ricerca cardiovascolare. In particolare, potremo comprendere meglio cosa impedisce ai cardiomiociti dei mammiferi adulti di entrare e completare il ciclo cellulare.Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere ottenuta una resa elevata di cardiomiociti vitali da topo adulto per colture a lungo termine. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le procedure di estrazione e canulazione del cuore sono difficili, ma devono essere eseguite rapidamente ed in modo efficiente. Per estrarre il cuore, iniziare trattando un topo adulto con cinque unità internazionali di eparina per chilogrammo di peso corporeo mediante iniezione intraperitoneale.Attendere 20 minuti per permettere all'eparina di circolare fino al cuore. Quindi, dopo aver somministrato l'anestesia, verificare l'assenza di risposta alla compressione delle dita dei piedi e ai riflessi corneali e fissare gli arti dell'animale al piano operatorio con del nastro adesivo. Disinfettare l'area dell'incisione applicando abbondantemente etanolo al 70 percento, quindi asciugare delicatamente i peli con un panno da laboratorio.Successivamente, utilizzare una pinzetta per sollevare la pelle appena al di sotto dello sterno ed eseguire un'incisione laterale attraverso la pelle e il peritoneo. Quindi, utilizzando pinze emostatiche, sollevare delicatamente la gabbia toracica tramite lo sterno ed usare piccole forbici da dissezione per estendere l'incisione in forma di V verso l'asse del corpo. Tagliare attraverso la prima costola e perforare il diaframma su ciascun lato, mantenendo la gabbia toracica sollevata con le pinze emostatiche.Utilizzando piccole forbici da iridectomia, recidere completamente il diaframma. Quindi usare le pinze emostatiche per retrarre la gabbia toracica in senso rostrale ed estendere rapidamente ma con attenzione l'incisione attraverso la gabbia toracica in direzione assiale su entrambi i lati. Retrarre completamente la sezione centrale della gabbia toracica, appoggiando le pinze emostatiche collegate per mantenere i tessuti in posizione, ed asportare il pericardio con pinzette fini.Successivamente, utilizzare pinze curve per sollevare delicatamente il cuore e sezionare le vene e le arterie ad esso collegate. Lavare il cuore in tampone di perfusione ghiacciato, quindi trasferire il cuore su un piccolo pezzo di rete da 215 micron. Aggiungere tampone di perfusione ghiacciato per rallentare le contrazioni miocardiche e posizionare la piastra sotto un microscopio per dissezione.Utilizzando forbici da iride fini, rimuovere eventuali tessuti non cardiaci in eccesso. Successivamente, recidere l'aorta in prossimità dell'arteria brachiocefalica, avendo cura di non far entrare bolle d'aria o detriti tessutali nell'apertura. Per cannuolare il cuore, riempire la piastra di Petri con tampone di perfusione freddo di ghiaccio fino a quando la soluzione non supera il livello dell'apertura della cannula da 18 gauge.Quindi, mantenendo la punta della cannula e l'aorta al di sotto della superficie del buffer, infilare l'aorta sulla cannula fino a quando la punta dell'ago si trova appena al di là della valvola aortica. Far scorrere un legaccio di seta 7-0 precedentemente annodato lungo il fusto dell'ago di cannulazione finché il legaccio si trova appena sopra la punta dell'ago e stringere il nodo con pinze fini. Posizionare un secondo legaccio appena sopra il primo.Quindi premere lentamente la siringa fino a quando 0,5 millilitri di tampone di perfusione non sono stati iniettati attraverso la vascolarizzazione coronarica. Dopo aver rimosso la siringa, collegare la cannula al portello di uscita della perfusione. Al termine della perfusione, utilizzare la pinzetta per rimuovere il cuore dalla cannula e posizionare il cuore in una piastra di Petri vuota.Utilizzando forbici da iridectomia fini, rimuovere rapidamente il tessuto ventricolare in eccesso e lavare i ventricoli in una nuova capsula di Petri contenente tampone di perfusione. Dopo il lavaggio, trasferire i ventricoli in una capsula di Petri asciutta e posizionarla in una cappa sterile. Raccogliere 7,5 millilitri di tampone di digestione dalla giacca riscaldata del sistema di perfusione e aggiungere 2,8 microlitri di cloruro di calcio uno molare.Mescolare la soluzione capovolgendola. Quindi aggiungere due o tre millilitri del buffer di digestione integrato con cloruro di calcio ai ventricoli. Utilizzando pinzette fini, triturare rapidamente il tessuto ventricolare fino a quando la maggior parte dei frammenti ha dimensioni inferiori a un millimetro cubo, e aggiungere il restante buffer di digestione integrato con cloruro di calcio ai tessuti dissociati.Mescolare i frammenti con un'agitazione delicata. Incubare quindi a 37 gradi Celsius e al 5 percento di anidride carbonica, continuando ad agitare ogni due minuti, fino a quando non sarà stato rilasciato un numero sufficiente di cardiomiociti. Successivamente, riportare la piastra nell'ambiente sterile del capo aspirante e utilizzare una pipetta di trasferimento per dissociare ulteriormente il tessuto in modo delicato.Indossando guanti sterili, piegare la maglia da 215 micron a forma di cono e tenerla sopra un tubo conico da 50 millilitri. Pipettare la sospensione di tessuto sulla maglia e lasciare che il filtrato defluisca nel tubo. Risciacquare successivamente con 7,5 millilitri di buffer di arresto preriscaldato.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri e lasciare sedimentare le cellule per gravità per 15 minuti. Quindi utilizzare una nuova pipetta di trasferimento per rimuovere con attenzione il soprannatante fino a quando rimangono solo da 50 a 100 microlitri di soluzione sopra le cellule. Aggiungere 10 millilitri di mezzo di coltura preriscaldato ed equilibrato alle cellule e mescolare mediante inversione delicata.Infine, dopo un'ulteriore incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, utilizzare una nuova pipetta di trasferimento per rimuovere il soprannatante dalle cellule sedimentate, lasciando solo da 50 a 100 microlitri di mezzo. Immediatamente dopo l'isolamento, i cardiomiociti mantengono un aspetto prevalentemente allungato con sarcomeri integri e una membrana esterna ben definita in illuminazione a campo chiaro. L'immunomarcatura per marcatori sarcomerici specifici dei cardiomiociti, come l'alfa-actinina, rivela un chiaro modello a bande sarcomerico.Dopo alcuni giorni di coltura, i cardiomiociti assumono una morfologia arrotondata. Entro una o due settimane, i cardiomiociti vitali si attaccano al substrato e iniziano a espandersi. La trasduzione con adenovirus, come osservato in questi cardiomiociti positivi per GFP, può essere utilizzata per ottenere un'espressione genica elevata entro 48-72 ore.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore se eseguita correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di ottenere una cannullazione sicura, priva di bolle d'aria, al fine di perfondere in modo efficiente la vascolarizzazione coronarica. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'immunomarcatura o l'imaging in tempo reale per rispondere a domande come: perché i cardiomiociti mammiferi adulti sono resistenti alla divisione cellulare?Non dimenticare che lavorare con l'adenovirus può essere estremamente pericoloso, quindi è necessario seguire adeguate precauzioni, come ad esempio operare all'interno di una cappa microbiologica di classe due.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Adulti miociti cardiaci sono cellule primarie che possono essere isolati da cuori animali e coltivate per diversi giorni. In questo periodo la cultura trasferimento genico adenovirali possono essere usate per esprimere biosensori geneticamente codificato (GEBS) o proteine ​​di fusione fluorescenti. Entrambi gli approcci consentono indagini cellulari mediante microscopia confocale.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Culture del mouse cardiomiociti primari sono uno degli strumenti cardine per l'indagine di organizzazione e la funzione miofibrillare. Il protocollo che segue descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti primari di cuori neonatali mouse. Le risultanti colture di cardiomiociti possono successivamente essere utilizzati per una varietà di biomeccanici, saggi biochimici e cellule biologiche.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

Descriviamo un metodo affidabile per l'isolamento di cardiomiociti di topo adulto. Questo protocollo produce un risultato coerente per la cultura di cardiomiociti adulti funzionali da una varietà di topi geneticamente modificati.

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC). ARVC isolata può essere utilizzato per la coltivazione di breve e lungo termine. L'isolamento e la coltura di ARVC possono giocare un ruolo chiave nello sviluppo di nuovi regimi di trattamento per malattie cardiache.

Isolamento e coltura dei cardiomiociti di ratto adulto.

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento, la trasfezione e la cultura a lungo termine dei cardiomiociti adulti di topi e ratti.

Isolamento, trasfezione e cultura a lungo termine di cardiomiociti per topi e ratti adulti

Un metodo è descritto per l'isolamento simultaneo di miociti e non miociti sia dagli atri che dai ventricoli di un singolo cuore adulto di topo. Questo protocollo si traduce in rese costanti di miociti cardiaci altamente vitali e non miociti e descrive in dettaglio le condizioni ottimali di coltura specifica delle cellule per la fenotipizzazione e l'analisi in vitro.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

Il gold standard in cardiologia per esperimenti funzionali cellulari e molecolari sono i cardiomiociti. Questo articolo descrive gli adattamenti alla tecnica non-Langendorff per isolare i cardiomiociti di topo.

Un metodo semplice ed efficace per isolare in modo coerente i cardiomiociti di topo

Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

Singoli profili di espressione delle cellule consente la dettagliata analisi di espressione genica di cellule singole. Noi descrivere i metodi per l'isolamento dei cardiomiociti, e preparare il lisati risultante sia per microarray intero trascrittoma o qPCR di obiettivi specifici.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

Impara l'isolamento, la coltura e la trasduzione di cardiomiociti di topo adulto con elevata resa e vitalità. Questo metodo supporta la ricerca cardiovascolare e lo studio del ciclo cellulare.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

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