Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Questo protocollo descrive un metodo passo-passo per l'isolamento riproducibile e la coltura a lungo termine di cardiomiociti di topo adulto con alta resa, purezza e vitalità.

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cardiomiociti primari di topo adulto vitali per la coltura e la trasduzione del vettore adenovirale. Questo metodo risponderà ad alcune delle domande chiave nel campo della ricerca cardiovascolare. In particolare, possiamo regolare ciò che impedisce ai cardiomiociti adulti di entrare e completare il ciclo cellulare.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può ottenere un'alta resa di cardiomiociti di topo adulto vitali per colture a lungo termine. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le procedure di estrazione e incannulamento del cuore sono difficili, ma devono essere eseguite in modo rapido ed efficiente. Per estrarre il cuore, iniziare trattando un topo adulto con cinque unità internazionali di eparina per grammo di peso corporeo mediante iniezione intraperitoneale.

Attendere 20 minuti per consentire all'eparina di circolare nel cuore. Quindi, dopo aver somministrato l'anestesia, confermare la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e ai riflessi corneali e fissare gli arti dell'animale a una piattaforma chirurgica. Sterilizzare l'area dell'incisione, con un'applicazione generosa di etinolo al 70%, quindi asciugare i capelli con una salvietta da laboratorio.

Quindi, usa una pinza per sollevare la pelle appena sotto lo sterno e praticare un'incisione laterale attraverso la pelle e il peritoneo. Quindi, utilizzando gli emostatici, sollevare delicatamente la gabbia toracica attraverso lo sterno e utilizzare piccole forbici da dissezione per estendere l'incisione a forma di V verso l'assiale. Tagliare la prima costola e forare il diaframma su ciascun lato, mantenendo la gabbia toracica sollevata con gli emostatici.

Usando piccole forbici dell'iride, sezionare completamente il diaframma. Quindi utilizzare gli emostatici per ritrarre la gabbia toracica rostralmente e rapidamente ma con attenzione estendere l'incisione attraverso la gabbia toracica verso l'assialmente su entrambi i lati. Ritrarre completamente la sezione centrale della gabbia toracica, posando gli emostatici attaccati per tenere il tessuto in posizione, e rimuovere il pericardio con una pinza fine.

Successivamente, usa una pinza curva per sollevare delicatamente il cuore e sezionare le vene e le arterie attaccate. Lavare il cuore in un tampone di perfusione ghiacciato, quindi trasferire il cuore su un piccolo pezzo di maglia da 215 micron. Aggiungere un tampone di perfusione ghiacciato per rallentare le contrazioni miocardiche e posizionare il piatto sotto un microscopio da dissezione.

Usando le forbici dell'iride fine, taglia tutto il tessuto non cardiaco di accesso. Quindi sezionare l'aorta vicino all'arteria brachiocefalica, facendo attenzione a non far entrare bolle o detriti di tessuto nell'apertura. Per incannulare il cuore, riempire la capsula di Petri con un tampone di perfusione ghiacciato fino a quando la soluzione non supera l'apertura della cannula calibro 18.

Quindi, mantenendo la punta della cannula e dell'aorta sotto la superficie del tampone, inguainare l'aorta sulla cannula fino a quando la punta dell'ago non è appena distale alla valvola aortica. Far scorrere una sutura di seta 7-0 pre-legata lungo l'asta dell'ago di incannulamento fino a quando la sutura non si trova appena sopra la punta dell'ago e stringere il nodo con una pinza fine. Posizionare una seconda sutura appena sopra la prima.

Quindi premere lentamente la siringa fino a quando non sono stati iniettati 0,5 millilitri di tampone di perfusione attraverso il sistema vascolare coronarico. Dopo aver rimosso la siringa, collegare la cannula alla porta di uscita della perfusione. Al termine della perfusione, utilizzare una pinza per rimuovere il cuore dalla cannula e posizionare il cuore in una capsula di Petri vuota.

Usando le forbici sottili dell'iride, taglia rapidamente il tessuto extraventricolare e lava i ventricoli in una nuova capsula di Petri contenente tampone di perfusione. Dopo il lavaggio, trasferire i ventricoli in una capsula di Petri asciutta e metterli in una cappa sterile. Raccogliere 7,5 millilitri di tampone di digestione dalla camicia di calore del sistema di perfusione e aggiungere 2,8 microlitri di cloruro di calcio molare.

Mescolare la soluzione per inversione. E poi aggiungere due o tre millilitri di tampone per la digestione integrato con cloruro di calcio ai ventricoli. Usando una pinza fine, tritcherare rapidamente il tessuto ventricolare fino a quando la maggior parte dei pezzi non sono più piccoli di un millimetro cubo e aggiungere il tampone di digestione supplementato con cloruro di calcio rimanente ai tessuti dissociati.

Mescolare i frammenti agitando delicatamente. E incubarli a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica con agitazione continua ogni due minuti fino a quando non è stato rilasciato un numero sufficiente di cardiomiociti. Quindi rimettere la piastra nella cappa a flusso laminare e utilizzare una pipetta di trasferimento per dissociare delicatamente il tessuto ulteriormente.

Indossando guanti sterili, piegare la rete da 215 micron in un cono e tenerla su un tubo conico da 50 millilitri. Pipettare l'impasto di tessuto sulla rete e lasciare che il filtrato defluisca nella provetta. Seguito da un lavaggio con 7,5 millilitri di tampone di arresto preriscaldato.

Trasferire la sospensione cellulare in un conico da 15 millilitri e lasciare che le cellule si depositino per gravità per 15 minuti. Quindi utilizzare una nuova pipetta di trasferimento per rimuovere con cura il surnatante fino a quando rimangono solo 50-100 microlitri di soluzione sopra le cellule. Aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura bilanciato preriscaldato alle cellule e mescolare per inversione delicata.

Infine, dopo altri 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente, utilizzare una nuova pipetta di trasferimento per rimuovere il surnatante dalle cellule sedimentate, fino a quando rimangono solo 50-100 microlitri di terreno. Immediatamente dopo l'isolamento, i cardiomiociti mantengono un aspetto per lo più a forma di bastoncino con sarcomeri intatti e una membrana esterna affilata sotto l'illuminazione a campo pieno. L'immunocolorazione per i marcatori sarcomerici specifici dei cardiomiociti, come l'alfa actinina, rivela un distinto pattern di bande sarcomeriche.

Dopo diversi giorni di coltura, i cardiomiociti assumono una morfologia arrotondata. Entro una o due settimane, i cardiomiociti vivi si attaccano al substrato e iniziano a diffondersi. La trasduzione con adenovirus, come osservato in questi cardiomiociti GFP positivi, può essere utilizzata per ottenere una forte espressione genica entro 48-72 ore.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottenere una cannulazione sicura e priva di bolle d'aria per abbondantere in modo efficiente la vascolarizzazione coronarica. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunocolorazione o l'imaging dal vivo per rispondere a domande come: perché i cardiomiociti dei mammiferi adulti sono resistenti alla divisione cellulare?

Non dimenticare che lavorare con l'adenovirus può essere estremamente pericoloso, quindi è necessario seguire le precauzioni appropriate, come lavorare in una cabina di biosicurezza di classe due.