Iniezione di cellule singenici del topo melanoma per determinare il loro potenziale metastatico nei polmoni

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo per la produzione di tumori metastatici in sei topi neri. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunoterapia, come il modo in cui gli agenti investigativi influenzano la risposta immunitaria nei polmoni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di metastasi sperimentali.

Quindi i risultati sono affidabili e relativamente coerenti. Per iniziare, posizionare colture di cellule di melanoma B16-BL6, che dovrebbero essere a circa il 70% di confluenza, in una cappa sterile. Quindi, aggiungi un millilitro di tripsina EDTA allo 05% a ciascun piatto e lascia le cellule per un minuto.

Dopo aver aspirato questa soluzione, procedere all'aggiunta di un millilitro di tripsina a ciascuna piastra, quindi rimettere le cellule nell'incubatrice. Dopo 10 minuti, spostare le cellule in una cappa sterile e aggiungere quattro millilitri di terreno RPMI privo di siero a ciascuna piastra. Quindi raccogliere le cellule con una pipetta motorizzata sterile.

Per rompere i grumi che potrebbero potenzialmente ostruire l'ago di espulsione, premere la punta della pipetta contro il fondo della piastra ed espellere le cellule. Dopo aver ripetuto più volte questo processo, raccogliere le cellule e trasferirle in una provetta conica da 15 millilitri. Quindi rimuovere un campione della sospensione cellulare, introdurlo in un emocitometro e determinare la densità cellulare.

Allocare equamente la sospensione cellulare in quattro provette da 15 millilitri. Quindi centrifugare le provette e successivamente decantare il surnatante. Procedere all'etichettatura di ciascuna provetta con una diversa densità di cellule: 0,063, 0,125, 0,25 o 0,5 milioni di cellule per millilitro.

Quindi aggiungere un volume appropriato di RPMI libero sierico a ciascuna conica per produrre queste concentrazioni finali. Confermare le densità cellulari desiderate utilizzando un emocitometro. Successivamente, allocare 500 microlitri di ciascuna sospensione in tubi etichettati da 1,8 millilitri posizionati sul ghiaccio.

Dopo che tutte le sospensioni cellulari B16-BL6 sono state preparate, selezionare un mouse. Tenendolo per la coda, guidare prima la parte posteriore dell'animale in un sistema di contenimento. Quando il busto del topo si trova nella camera principale e la coda all'esterno dell'apparecchio, procedere a tirare l'animale verso l'estremità del sistema di contenzione.

Quindi, inserire lo stantuffo di ritenuta e continuare a spingere sullo stantuffo finché il mouse non è sicuro. Una volta che l'animale è in posizione, ruota il topo di 90 gradi in modo che una delle vene laterali della coda sia rivolta verso l'alto. Quindi usa un tampone imbevuto di alcol per pulire energicamente il lato della coda del topo dove la vena è più visibile.

Per prepararsi all'iniezione, raccogliere prima 300 microlitri di 0,5 milioni di cellule per millilitro di sospensione in una siringa. Successivamente, espellere le bolle dalla siringa capovolgendolo, muovendo il lato e spingendo lo stantuffo. Una volta rimosse le bolle, espellere la coltura cellulare per ottenere un volume finale di 250 microlitri nella siringa.

Procedi ad estendere la coda del topo con la mano non dominante. Tienilo in modo che l'indice sollevi l'estremità prossimale della coda e il pollice prema la parte distale. Con la mano dominante, inserire l'ago nella vena verso l'estremità distale della coda con un angolo minuto verso il basso.

Quindi inserire ulteriormente l'ago, regolandolo in modo che corrisponda all'angolo della vena caudale. Dopo che l'ago è stato inserito per circa un centimetro nella vena caudale, iniziare a spingere lo stantuffo tenendo ferma la siringa. Fermare qualsiasi sanguinamento tenendo una garza contro il sito di ingresso.

Una volta espulsa la sospensione cellulare, rimuovere l'ago dalla vena e gettarlo. Quindi, rimuovere lo stantuffo dal sistema di ritenuta e posizionare il mouse in una gabbia ricevente. Questo protocollo mirava a identificare il numero ottimale di cellule B16-BL6 da iniettare per creare un modello utile di melanoma metastatico.

Qui sono mostrati focolai sperimentali indicati da frecce formate nei polmoni due o tre settimane dopo l'iniezione di cinque diverse densità cellulari. Quando sono state iniettate 500.000 cellule per millilitro, i focolai hanno coperto completamente i polmoni. Nell'esempio mostrato qui, sono stati contati 102 fuochi.

Al contrario, i polmoni erano scarsamente coperti di focolai solo quando sono state iniettate 62.500 cellule per millilitro o 125.000 cellule per millilitro. Rispettivamente, queste densità hanno portato a una conta dei focolai polmonari di uno e 17. Utilizzando questo metodo, è stato determinato che la concentrazione ottimale di cellule da iniettare era di 250.000 cellule per millilitro.

Questa densità ha portato a polmoni con circa 65 focolai, un numero in cui gli organi non erano né completamente coperti né troppo scarsamente coperti da focolai. Un'ulteriore enumerazione di questi dati, quando rappresentati graficamente, dimostra una relazione approssimativamente lineare tra focolai polmonari e densità di colture cellulari superiore a 125.000 cellule per millilitro, come mostrato qui. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora, a seconda del numero di topi, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di procedura, è importante ricordare di provare a iniettare un numero equivalente di cellule per topo. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la somministrazione di farmaci, per rispondere a domande come il modo in cui le potenziali terapie influenzano una serie di focolai risultanti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori sul cancro per esplorare i costituenti del cancro metastatico nel melanoma nei sei topi neri.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere e preparare le cellule B16-BL6, trattenere i topi, preparare gli aghi e iniettare un numero equivalente di cellule in ciascuna vena della coda. Non dimenticare che lavorare con la cultura dei mammiferi e gli aghi può essere estremamente pericoloso e dovrebbero essere sempre prese precauzioni, come evitare punture di aghi e indossare indumenti protettivi.