Saggi per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule mal ripiegate

Questo rapporto descrive i protocolli per misurare i tassi di degradazione delle proteine mal ripiegate mediante western blot o saggi basati sulla fluorescenza. I metodi possono essere applicati all'analisi di altre proteine mal ripiegate e per lo screening ad alto rendimento.

L'obiettivo generale di questo test è misurare i tassi di degradazione cellulare delle proteine mal ripiegate. Le proteine mal ripiegate sono associate a molte malattie neurodegenerative. Questo test aiuta a studiare i sistemi di controllo della qualità delle proteine cellulari che sono protettori contro le proteine aberranti.

Le proteine inclini al ripiegamento errato possono esistere in diverse forme nelle cellule. Combinando il frazionamento cellulare con il metodo del cicloesano, il vantaggio principale di questa tecnica è quello di misurare in modo specifico l'emivita delle specie mal ripiegate. Usiamo due proteine modello come esempi.

Una proteina poliglutammato altamente incline all'aggregazione, Atxn1 82Q e un mutante della luciferasi nucleare conformazionalmente instabile. Il protocollo può essere applicato anche ad altre misure di proteine mal ripiegate. Per eseguire un saggio di degradazione per la GFP Atxn1 82Q, piastra circa 3x10^5 cellule HeLa in piastre da 35 millimetri con terreno DMEM e 10% FBS.

Incubare le cellule durante la notte in modo che raggiungano il 40-60% di confluenza al momento della trasfezione. Da quattro a cinque ore dopo la trasfezione delle cellule con Atxn1 82Q GFP PRK5, al microscopio a fiorescenza, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione da 450 a 490 nanometri per esaminare le cellule vive per l'espressione di GFP nei nuclei, caratterizzati dalla presenza di macchie diffuse e piccole di segnali GFP. Poco prima del trattamento con cicloesimide, raccogliere una piastra di cellule rimuovendo il terreno e utilizzando tre millilitri di PBS ghiacciato per lavare le cellule due volte.

Quindi congelare a scatto la piastra su ghiaccio secco. Per le restanti piastre di cellule, rimuovere il terreno mediante aspirazione sottovuoto e aggiungere due millilitri di DMEM fresco contenente 50 microgrammi per millilitro di cicloesimide. Aggiungere anche 10 micromolari dell'inibitore del proteasoma, MG132 a una piastra.

Incubare le cellule trattate per quattro, otto, 12 e 16 ore prima di congelarle su ghiaccio secco. Dopo aver raccolto le cellule trattate con MG132 a 16 ore, raschiare le cellule congelate da tutte le piastre in 150 microlitri di tampone di lisi cellulare ghiacciata e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare i lisati in una centrifuga da banco a 17.000 g e quattro gradi Celsius per 15 minuti.

Quindi trasferire il surnatante che contiene proteine solubili MP40 in un'altra provetta. Sciacquare i pellet aggiungendo delicatamente circa 200 microlitri di 1x PBS ai tubi senza disturbare i pellet. Rimuovere con cautela il PBS mediante aspirazione o pipetta, risospendere i pellet in 150 microlitri di tampone per pellet ghiacciato e poi incubarli sul ghiaccio per 15-30 minuti.

Quindi aggiungere 75 microlitri di tampone bollente 3x nelle frazioni solubili MP40 e nelle frazioni insolubili MP40 risospese dai pellet. Quindi riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius su un blocco termico per cinque minuti. Aggiungere il tampone di caricamento del gel SDS a un'aliquota di frazioni solubili e insolubili di MP40 bollite.

Caricare volumi uguali di campioni raccolti da tutti i punti temporali su un gel SDS-PAGE. Rilevare la GFP solubile in MP40 e SDS solubile in Atxn1 82Q mediante Western blot utilizzando anticorpi anti GFP e chemiluminescenza potenziata. Per esaminare l'Atxn1 82Q resistente alla SDS dalla frazione del pellet con un saggio di ritardo del filtro, impostare un apparato dot plot contenente una membrana in acetato di cellulosa da 0,2 micron.

Quindi caricare da 80 a 120 microlitri di campioni insolubili di MP40 bolliti in ciascun pozzetto dell'apparato dot blot. Dopo aver filtrato i campioni attraverso la membrana mediante vuoto, rilevare gli aggregati GFP Atxn1 82Q bloccati sulla membrana mediante immunoblotting anti GFP. È fondamentale utilizzare un test di ritardo del filtro per esaminare i livelli di forma resistente alla SDS nel tempo.

Questo perché la forma solubile SDS può trasformarsi in una forma resistente alla SDS piuttosto che essere degradata. In questo esempio, la forma resistente alla SDS è minima e rimane a un livello simile rispetto all'esperimento di inseguimento. Per effettuare un saggio di degradazione, dopo una trasfezione notturna di cellule HeLa con NLS-luciferasi-GFP, esaminare le cellule vive al microscopio a fluorescenza invertita per l'espressione di GFP con una lunghezza d'onda di eccitazione compresa tra 450 e 490 nanometri.

Poco prima del trattamento con cicloesimide, raccogliere una piastra di cellule rimuovendo il terreno e utilizzare tre millilitri di PBS ghiacciato per lavare le cellule due volte. Quindi congelare a scatto la piastra su ghiaccio secco. Per le restanti piastre, dopo aver rimosso il terreno, aggiungere due millilitri di DMEM fresco contenente 50 microgrammi per millilitro di cicloesimide e aggiungere 10 micromolari dell'inibitore del proteasoma MG132 a una piastra.

Trattare le cellule per 1,5, tre, 4,5 e sei ore prima del prelievo come appena descritto, raccogliendo le cellule trattate con MG132 a sei ore. Dopo aver raccolto l'ultimo punto temporale delle cellule, raschiare ogni piastra in 150 microlitri di tampone di lisi cellulare ghiacciato e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Incubare i campioni su blocco termico a 95 gradi Celsius per cinque minuti, prima di eseguire SDS-PAGE e Western blotting secondo il protocollo di testo.

Aggiungere il tampone di caricamento su gel SDS ai lisati cellulari interi per una concentrazione finale del 2% di SDS e 50 millimolari di DTT. Dopo aver seminato e trasfecato le cellule HeLa in piastre a 96 pozzetti secondo il protocollo di testo, da 20 a 24 ore dopo la trasfezione, esaminare le cellule per l'espressione di GFP. Rimuovere il terreno, aggiungere circa 200 microlitri di 1x PBS a ciascun pozzetto e poi aspirarlo per rimuovere il DMEM residuo.

Aggiungere 60 microlitri di DMEM a bassa fluorescenza con il 5% di FBS e 50 microgrammi per millilitro di cicloesimide e aggiungere 10 micromolari di MG132 a una serie di campioni. Con un lettore di piastre a fluorescenza, è possibile misurare il segnale GFP, leggendo le piastre ogni ora per un massimo di 8-10 ore. Esporta i dati ed esegui analisi statistiche secondo il protocollo di testo.

In un'analisi allo stato stazionario, aggregati nucleari di GFP Atxn1 82Q visibili al microscopio possono essere osservati nel 30-50% delle cellule HeLa 20 ore dopo la trasfezione. Come si vede qui mediante Western blot, l'emivita della GFP di Atxn1 82Q nella frazione solubile SDS è di circa cinque ore. Al contrario, una diminuzione lieve o nulla della GFP di Atxn1 82Q nella frazione solubile MP40 nell'arco di 16 ore.

La degradazione della GFP Atxn1 82Q è parzialmente inibita dal trattamento delle cellule con MG132. Queste immagini illustrano che 20 ore dopo la trasfezione, gli aggregati GFP mutanti NLS-luciferasi DM diventano microscopicamente visibili nel 5-15% delle cellule HeLa. I Western blot hanno rivelato che l'emivita della GFP solubile NLS-luciferasi DM solubile in SDS è di due o tre ore.

Inoltre, l'intensità della flessione delle cellule trasfettate diminuisce nel tempo con il trattamento con cicloesimide. A circa sei ore dal trattamento con cicloesimide, la GFP solubile NLS-luciferasi DM mutante è in gran parte degradata, suggerendo che la fluorescenza rimanente è generata da specie aggregate resistenti alla degradazione. Queste immagini di florescenza confermano che la GFP aggregata, ma non diffusa, rimane nelle cellule nove ore dopo il trattamento con cicloesimide.

Beh, il test basato sull'immunblotting richiede alcuni giorni per essere completato. I tassi di degradazione delle proteine possono essere ottenuti immediatamente dopo l'inseguimento della cicloesimide utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza. Sia i saggi basati sull'immunoblotting che quelli basati sulla fluorescenza possono essere applicati agli studi di altre proteine mal ripiegate.

Quest'ultimo è adatto anche per lo screening ad alto rendimento per l'identificazione di macromolecole o piccoli composti in grado di modulare la degradazione di proteine mal ripiegate. È importante ricordare che per alcune proteine mal ripiegate come Atxn1 82Q, l'emivita può essere misurata solo attraverso il frazionamento cellulare e l'immunoblotting e questo perché le specie mal ripiegate che si degradano rapidamente sono solo una piccola parte dell'espressione complessiva di Atxn1 82Q. Per scoprire il meccanismo dei controlli di qualità delle proteine, i saggi di degradazione delle proteine devono essere abbinati all'analisi dei livelli di stato stazionario degli aggregati e del fatto che si tratti di partizioni in diverse frazioni cellulari.

Possono essere eseguiti anche altri esperimenti come il ripiegamento delle proteine in vitro e i saggi di aggregazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare i tassi di degradazione delle proteine mal ripiegate utilizzando diverse strategie. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.