Studiare il ruolo dei macrofagi alveolari in Breast Cancer metastasi

Qui descriviamo il modello e l'approccio per studiare le funzioni dei macrofagi alveolari polmonari nelle metastasi del cancro. Per dimostrare il ruolo di queste cellule nelle metastasi, è stato utilizzato il modello singenico (4T1) del carcinoma mammario in combinazione con la deplezione dei macrofagi alveolari con liposomi di clodronato.

L'obiettivo generale di questi esperimenti è determinare il ruolo dei macrofagi alveolari polmonari nelle metastasi tumorali utilizzando un modello singenaico di carcinoma mammario. Questo metodo può rispondere ad alcune delle domande chiave nell'immunologia dei tumori e nei campi delle metastasi tumorali, come ad esempio perché i polmoni sono uno dei bersagli più comuni delle metastasi tumorali epatogene. Il vantaggio principale di questo metodo è che utilizza un modello di cancro al seno molto ben consolidato con un metodo molto specifico dei microfagi alveolari polmonari.

A dimostrare questa procedura sarà Surya Kumari Vadrevu, un ricercatore associato nel mio laboratorio. Il giorno dell'iniezione delle cellule tumorali, posizionare prima un topo rasato e anestetizzato su un tampone chirurgico. Successivamente, aspirare una volta 10 alla quinta cellula tumorale in 100 microlitri di PBS in una siringa da insulina da cinque millilitri a punto zero dotata di un ago calibro 29.

Quindi usa il pollice e l'indice per sollevare la pelle vicino al secondo e al terzo capezzolo e inserisci l'ago sotto la pelle nel cuscinetto adiposo mammario appena sotto il terzo capezzolo. Iniettare lentamente per via sottocutanea le cellule per formare una bolla sotto la pelle e riportare l'animale nella sua gabbia con monitoraggio fino a quando non si è completamente ripreso. Quattro o cinque giorni dopo l'inoculazione, per misurare i tumori, palpare il sito del tumore e utilizzare un calibro per utilizzare sia il diametro più grande che quello più piccolo dei tumori per determinare il volume del tumore.

Per visualizzare le cellule 41GFP iniettate, posizionare il topo anestetizzato su un tavolino mobile all'interno dell'imager e visualizzare il sito del tumore mediante microscopia a fluorescenza. In una cabina di biosicurezza a flusso d'aria laminer, sei giorni dopo l'iniezione delle cellule tumorali, agitare i liposomi per distribuire uniformemente le particelle e aspirare 60 microlitri di sospensione in un puntale di pipetta sterile. Posizionare la punta vicino alla narice dell'animale anestetizzato inoculato con tumore e rilasciare lentamente cinque microlitri della soluzione liposomiale, consentendo al topo di inalare la goccia.

È fondamentale somministrare la soluzione liposomica lentamente mantenendo il livello di anestesia appropriato per consentire all'animale di respirare regolarmente durante il parto. Quando sono stati somministrati tutti i 60 microlitri, lasciare che il topo si riprenda completamente e riportare l'animale nella sua gabbia. Per contare e valutare le metastasi della superficie polmonare, posizionare i polmoni al microscopio da dissezione e focalizzare l'obiettivo fino a ottenere una visione chiara della superficie polmonare.

Quindi contare manualmente le metastesi sui lati anteriore e posteriore di entrambi i polmoni e visualizzare i tumori mediante microscopia a fluorescenza. Dopo aver contato e analizzato le metastasi, utilizzare forbici chirurgiche e pinze per tritare il polmone e trasferire i pezzi di tessuto in una provetta conica da 15 millilitri contenente tre millilitri di tampone digestivo. Testare i frammenti su un agitatore rotante in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 40 minuti, quindi triterare l'impasto per dissociare il tessuto.

Quindi, filtrare la sospensione tissutale attraverso un colino da 40 micron per rimuovere eventuali grumi, premendo i pezzi più grandi attraverso il colino con uno stantuffo a siringa, se necessario. Quando è stata ottenuta una sospensione unicellulare, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e lisare i globuli rossi con tampone ACK per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare il pellet due volte in otto millilitri di RPMI.

Dopo la seconda centrifugazione, sospendiamo le cellule in tre millilitri di terreno RPMI completo per il conteggio e facciamo girare nuovamente le cellule. Ora diluire le cellule a una volta 10 per 10 cellule per 100 microlitri di concentrazione di tampone FAX e trasferire 100 microlitri di eloquote di cellule in pozzetti individuali di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Raccogliere le cellule sul fondo dei pozzetti mediante centrifugazione, quindi capovolgere la piastra per far defluire il tampone.

Bloccare le celle con 100 microlitri di CD16 CD32 FC block per 15 minuti a quattro gradi Celsius e centrare nuovamente la piastra. Quindi capovolgere la piastra per rimuovere il surnatante, come appena dimostrato, e aggiungere il cocktail di anticorpi di interesse nei pozzetti appropriati. Dopo 30 minuti a quattro gradi Celsius, pellettare le celle mediante centrifugazione, seguita da un lavaggio con 200 microlitri di tampone FAX.

Quindi sospendi nuovamente i pellet in 200 microlitri di PBS fresco e colora i campioni con colorante vitale per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in altri 200 microlitri di PBS e fissare i campioni in 100 microlitri di paraformaldeide all'uno per cento per la conservazione a quattro gradi Celsius. Immediatamente prima della loro analisi, trasferire le sospensioni cellulari in provette per citometria a flusso in polipropilene.

L'iniezione di cellule tumorali 4T1GFP nel cuscinetto adiposo mammario porta alla formazione di tumori di topo che ricapitolano la diffusione metastatica del carcinoma mammario umano, come evidenziato dalle metastasi in rapida formazione osservate all'interno dei polmoni. La trasfezione stabile di cellule 4T1 con GFP facilita il tracciamento delle cellule tumorali metastatizzanti e la quantificazione del carico metastatico. L'artologia di routine, in combinazione con gli algoritmi di patologia digitale, fornisce anche un buon strumento per quantificare e verificare le metastasi.

Inoltre, l'analisi cicometrica a flusso multicolore consente la caratterizzazione anche di popolazioni cellulari rare, come i macrofagi alveolari CD11b negativi, CD11c F80 positivi. La deplezione del biclotrenato può essere confermata dall'assenza di queste cellule CD11c F480 positive nei polmoni dissociati degli animali trattati con liposomi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniettare le cellule tumorali nel cuscinetto adiposo mammario, monitorare la crescita e le metastasi del tumore, esaurire i macrofagi alveolari e preparare le cellule polmonari per l'analisi cicometrica a flusso.