Elettroforesi capillare per monitorare Peptide innesto su Chitosano film in tempo reale

L'obiettivo generale di questo metodo di elettroforesi capillare è quello di monitorare in tempo reale la reazione di innesto dei peptidi su film di chitosano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della chimica analitica e della chimica dei polimeri, come ad esempio come procede la reazione e quanto sia efficiente il processo di innesto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non è necessaria la preparazione del campione e la miscela di reazione può essere analizzata in tempo reale.

Anche se questo metodo può fornire informazioni sui processi di reazione, può anche essere applicato a un sistema, come il legame di un farmaco antitumorale a un vettore di farmaci o la digestione del riso o dei cereali per la colazione. Pesare due grammi di acido acetico glaciale e completare a 100 millilitri con acqua ultra pura. Aggiungere 100 millilitri di soluzione acquosa di acido acetico al 2% in massa a 1,7 grammi di polvere di chitosano.

Mescolare per cinque giorni con una barra di agitazione e una piastra di agitazione magnetica a temperatura ambiente, coperta con un foglio di alluminio o al buio. Centrifugare la dispersione di chitosano a 1,076 volte g a 23 gradi Celsius per un'ora. Dopo la centrifugazione, raccogliere il surnatante utilizzando una siringa e gettare il precipitato.

Per ogni film, aliquotare 10 millilitri di sospensione di chitosano in una capsula di Petri di plastica di nove centimetri a temperatura ambiente. Lasciare asciugare le pellicole coperte per almeno sette giorni. Con le forbici, tagliare le pellicole secche in quadrati di un centimetro per uno.

L'esperimento può essere messo in pausa in questa fase. Sciacquare 10 pellicole quadrate di chitosano in cinque millilitri di PBS per due ore in una capsula di Petri a temperatura ambiente. Durante questo periodo, preparare e convalidare lo strumento per elettroforesi capillare.

Preparare un capillare di silice fusa nuda di 43,5 centimetri con un diametro interno di 50 micrometri indebolendo il rivestimento esterno in polimero del capillare alla lunghezza impostata con un utensile smussato e quindi spezzando il capillare. Crea una finestra per il capillare usando un accendino per bruciare il rivestimento polimerico a 8,5 centimetri dall'ingresso. Dopo che il capillare si è raffreddato, pulirlo con etanolo.

Quindi, bruciare il rivestimento del capillare a ciascuna estremità per alcuni millimetri con un accendino. Dopo il raffreddamento, pulirlo con etanolo per la seconda volta. Posizionare il capillare all'interno della finestra di rilevamento e installarlo nella cassetta capillare posizionandolo a lunghezze uguali nell'ingresso e nell'uscita e avvolgendolo attorno ai mandrini della cassetta.

Quindi, installare la cassetta nello strumento per elettroforesi capillare. Imposta i parametri del metodo per ogni separazione. Nel menu del software, selezionare Metodo, quindi Modifica l'intero metodo.

Selezionare la scheda CE per modificare le condizioni CE. Impostare la temperatura, il tempo, la tensione e le fiale utilizzate per la separazione. Nella sezione Precondizionamento, impostare i risciacqui consecutivi.

Utilizzare 10 minuti con un idrossido di sodio molare, cinque minuti con idrossido di sodio 0,1 molare, cinque minuti con acqua ultra pura e cinque minuti con 75 millimolari di tampone borato di sodio a pH 9,2 per il primo metodo della sequenza. Controllare gli altri metodi nella sequenza seguendo la stessa procedura. Per i metodi successivi, impostare i lavaggi consecutivi nella sezione Precondizionamento su un minuto con un idrossido di sodio molare e cinque minuti con tampone borato di sodio 75 millimolare a pH 9,2.

Nella sezione Iniezione, impostare i parametri per un'iniezione idrodinamica con una pressione di 30 millibar per 10 secondi per tutti i metodi. Nella sezione Separazione, impostare le condizioni di separazione su 30 kilovolt, a 25 gradi Celsius per nove minuti per tutti i metodi. Iniettare e separare uno standard interno neutro.

Per lo standard interno neutro, utilizzare 10 microlitri di DMSO al 10% in volume in acqua diluita in 450 microlitri di tampone borato di sodio da 75 millimolari. Prima di iniziare la sequenza, assicurarsi che i parametri della sequenza siano impostati sulla cartella e sul numero di file corretti. Quindi premere Sequenza per avviare l'esperimento.

La separazione degli standard consente la convalida dello strumento prima dell'esecuzione di un esperimento. Questo è essenziale per il successo di un esperimento. Quindi iniettare e separare uno standard di oligoacrilato allo stesso modo per verificare la validità del capillare.

Mettere in pausa la sequenza fino a quando la reazione di innesto non è pronta per iniziare. Per eseguire l'innesto di RGDS su film di chitosano, pesare prima il peptide e gli agenti di accoppiamento. Due ore dopo l'inizio dell'immersione del film di chitosano in PBS, sciogliere il peptide e gli agenti di accoppiamento in cinque millilitri di PBS.

Prelevare un'aliquota di 50 microlitri di questa soluzione e aggiungere due microlitri di DMSO al 10% in volume in acqua come standard neutro interno. Analizzare l'aliquota con l'elettroforesi capillare utilizzando le stesse condizioni di analisi di prima. Quindi, rimuovere il PBS utilizzato per sciacquare le pellicole di chitosano dalla capsula di Petri.

Aggiungere la soluzione da cinque millilitri di peptide e agenti di accoppiamento alla piastra di Petri contenente le pellicole di chitosano. Coprire la capsula di Petri con pellicola di paraffina e posizionarla su uno shaker orbitale a temperatura ambiente. Assumere aliquote da 50 microlitri di terreno di reazione a tempi prestabiliti.

Le aliquote prelevate dal mezzo di reazione devono essere analizzate immediatamente. Le misure appropriate devono essere prese in rapida successione per consentire l'analisi in tempo reale. Aggiungere due microlitri di DMSO al 10% in volume in acqua come standard neutro interno a ciascuna aliquota.

Analizzare le aliquote con l'elettroforesi capillare non appena vengono prelevate. Al termine delle separazioni, sciacquare il capillare con acqua ultra pura per 10 minuti. Dopo quattro ore di agitazione e rimozione dell'aliquota, rimuovere la capsula di Petri dallo shaker.

Dopo aver rimosso il mezzo di reazione dalla capsula di Petri, aggiungere cinque millilitri di PBS per sciacquare le pellicole di chitosano. Togliete il PBS dalla capsula di Petri, sciacquate le pellicole di chitosano con acqua ultra pura e lasciatele asciugare per una notte. Conservare le pellicole a meno 20 gradi Celsius in una capsula di Petri di plastica.

I risultati rappresentativi della prima aliquota della reazione chimica mostrano una separazione dei diversi reagenti chimici. Il picco del peptide RGDS in questo momento è il punto di partenza della reazione e può essere utilizzato per quantificare l'efficienza dell'innesto. Poiché la reazione di innesto viene continuamente monitorata, l'area del picco RGDS continua a diminuire fino a rimanere costante, il che significa la fine dell'esperimento.

Un secondo picco a destra del picco EDC HCl appare come previsto quando la reazione procede. Un'integrazione del picco RGDS nel tempo consente di calcolare il consumo di peptidi. La spettroscopia NMR allo stato gonfio dei film di chitosano in PBS consente di rilevare l'innesto di RGDS, film di chitosano e film di chitosano innestati con il peptide RGDS o gonfi in PBS.

L'asterisco rappresenta i segnali assegnati a RGDS. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare tutte le soluzioni in anticipo.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la spettroscopia animale allo stato solido per rispondere a ulteriori domande, come la convalida diretta degli esperimenti grafici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'elettroforesi capillare in soluzione libera nel monitoraggio delle reazioni chimiche.