Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in Drosophila

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la neurodegenerazione nel cervello di Drosophila, causata da una varietà di fattori tra cui l'età, le modificazioni genetiche o le influenze ambientali, senza la necessità di una colorazione specifica. Questo metodo è molto utile nell'analisi di questioni chiave nel campo delle malattie neurodegenerative. Ad esempio, quali geni o fattori ambientali causano o contribuiscono a queste malattie?

Il vantaggio principale di questo metodo è che evita o riduce al minimo gli errori sistematici perché le mosche di controllo e le mosche sperimentali vengono trattate come un unico campione. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà, perché ci vuole pratica per garantire che l'area corretta del cervello sia sul vetrino e per prevenire danni che possono verificarsi durante il taglio. Per iniziare, usa prima una pinza per infilare le mosche del soggetto per il collo nei collari.

Allineare tutte le testine con lo stesso orientamento e assicurarsi che non si verifichino danni alla testa o agli occhi. Includi mosche Eyeless Senoculus in posizioni casuali e conosciute in modo che l'ordine delle mosche possa essere facilmente identificato nelle sezioni. Inoltre, se il ceppo di mosca di interesse ha occhi chiari o bianchi, infilare mosche dagli occhi rossi a intervalli lungo la striscia, per assicurarsi che sia presente una quantità sufficiente di pigmento per macchiare il vetrino.

Registrare l'ordine delle mosche, insieme al numero del collare se ne viene utilizzata più di una. Una volta terminato un collare, inseriscilo nella soluzione di Carnoy per tre virgola cinque o quattro ore. Eseguire una serie di lavaggi con etanolo, benzoato di metile e paraffina per preparare il tessuto del moscerino per l'inclusione.

Quindi, posiziona i collari in una vaschetta per cubetti di ghiaccio in gomma, per sezione. Versare delicatamente la paraffina fusa sui colletti, evitando bolle d'aria e lasciarla indurire durante la notte. Rimuovere i blocchi di paraffina contenenti i collari dal vassoio.

Separare il blocco di paraffina dal collare, usando una lama di rasoio. Spezzando delicatamente il colletto. I corpi rimarranno nel colletto, mentre le teste rimarranno nel blocco di paraffina.

Per sezionare il tessuto, riscaldare prima una piastra riscaldante a 50 gradi Celsius. Posizionare tutti gli strumenti che entreranno in contatto con la cera, come lame di rasoio o blocchi di montaggio in metallo, sulla piastra per riscaldarli. Determinare l'orientamento desiderato per il sezionamento, quindi fissare il segmento di paraffina al blocco di montaggio fondendolo brevemente sul lato di contatto.

Con una lama di rasoio, taglia la paraffina in eccesso lontano dalle teste delle mosche, in modo che rimanga solo una piccola fila contenente le testine incorporate. Posizionare il blocco di montaggio nel portaoggetti del Microtomo, allineando le teste parallelamente al bordo della lama. Tagliare sette sezioni micrometriche e trasferire il nastro di sezioni sui vetrini del microscopio.

Posizionare i vetrini su una piastra riscaldata a 37 gradi Celsius per circa un minuto, per consentire al nastro di espandersi. Rimuovere l'acqua in eccesso e quindi impostare gli scivoli in modo che si asciughino ulteriormente durante la notte. Una volta asciutta, rimuovere la cera di paraffina posizionando i vetrini verticalmente in un barattolo alto per la colorazione dei vetrini, riempito con agente di deparaffinazione per 30 minuti a un'ora.

Ripetere questo lavaggio tre volte. Infine, rimuovi i vetrini dal barattolo e posiziona due gocce di terreno di inclusione su ciascuno di essi. Copri le sezioni con un vetrino coprioggetti grande e lascia asciugare i vetrini per uno o due giorni.

A basso ingrandimento su un microscopio a fluorescenza, determinare l'orientamento del cervello e concentrarsi sulla regione di interesse. Una volta identificata questa regione, scatta le immagini richieste. Utilizzando il software di imaging, contare il numero di vacuoli per testa.

Misura la dimensione del vacuolo selezionando il vacuolo di interesse e determinando il numero di pixel coperti. Questa immagine mostra sezioni di diverse teste di mosca orientate da sinistra a destra. Dall'alto verso il basso, vengono visualizzate le sezioni seriali della stessa testa di mosca.

La mosca di controllo Eyeless Senoculus è indicata dalla freccia. Le sezioni sono macchiate dal pigmento oculare fluorescente naturalmente presente che lava le sezioni durante il taglio. Le sezioni della testa di paraffina di sette, 14 e 21 giorni di mosca Swiss Cheese One, mostrano un progressivo aumento del numero e dell'area del vacuolo legato all'età.

Questa degenerazione è quantificabile contando i vacuoli e calcolando l'area combinata ed è risultata significativa. Allo stesso modo, nelle mosche Wild Type, è stato dimostrato che la neurodegenerazione si verifica con l'età. Nell'esame delle sezioni della testa delle mosche Wild Type di 10, 30 e 60 giorni si sono visti formare pochi o nessun vacuolo nella condizione di 10 giorni.

Nel cervello degli individui di 30 giorni cominciavano a formarsi vacuoli. Negli individui di 60 giorni, erano presenti vacuoli significativamente più grandi e di area più ampia. Una volta padroneggiate, le sezioni possono essere disponibili per l'analisi entro una settimana.

Quando si utilizza questa procedura, è importante registrare attentamente l'ordine delle mosche nel collare. Per essere sicuri di poterli identificare in seguito, dopo l'analisi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le sezioni e quantificare la neurodegenerazione riscontrata nel cervello della Drosophila.