Intuizioni le interazioni di aminoacidi e peptidi con materiali inorganici Uso singola molecola Forza Spettroscopia

L'obiettivo generale della tecnica di spettroscopia di forza a singola molecola è determinare la forza di adesione e la natura delle interazioni tra amminoacidi o peptidi con superfici diverse. Questa materia può aiutare a rispondere a domande chiave nell'area della chimica delle superfici ed essere utilizzata per lo sviluppo di nuovi compositi e cordati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce informazioni sull'interazione tra la molecola desiderata e le superfici a livello di singola molecola.

Per iniziare, acquista cantilever AFM in nitruro di silicio dotati di punte in silicone con un raggio nominale a sbalzo di due nanometri. Montare la punta sul supporto. Pulire ciascuno dei cantilever AFM immergendoli nell'etanolo per 20 minuti e poi asciugarli a temperatura ambiente.

Quindi, posizionare le punte in una camera al plasma e trattare i cantilever esponendole al plasma di ossigeno per cinque minuti. Preparare una soluzione contenente 15 parti di metiltrietossisilano e una parte di tre amminopropiltrietossisilano e sospendere i canitlever tre centimetri sopra la soluzione mentre si trovano in atmosfera inerte. È importante che le punte e il supporto non tocchino la miscela di silani.

Inoltre, il silano è altamente sensibile all'umidità, e quindi queste punte devono essere eseguite in atmosfera inerte. Una volta sigillato, collegare l'essiccatore a una pompa a vuoto e applicare un vuoto per due ore per formare un monostrato dei due tipi di composti silani misti sulla superficie dei cantilever. Rimuovere con cautela le punte e posizionarle su una piastra calda preriscaldata a 70 gradi Celsius.

Lasciare asciugare le punte per 10 minuti. Raffreddare le punte a temperatura ambiente prima di immergerle in una soluzione di Fmoc-PEG-NHS per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, immergi le punte nel cloroformio per cinque minuti e poi nel DMF per altri cinque minuti.

Dopo l'incubazione in DMF, rimuovere la protezione dei gruppi Fmoc delle molecole PEG attaccate immergendo le punte in una soluzione di piperidina al 20% in DMF per 30 minuti. Ancora una volta, immergi le punte nel DMF per quattro minuti e poi nell'N-metil-2-pirrolidone per altri quattro minuti. Per accoppiare gli amminoacidi sulle punte, immergere per un'ora e mezza in una soluzione di accoppiamento aminoacidico con una concentrazione totale di 30 millimolari e cinque millilitri di N-metil-2-pirrolidone.

Per proteggere i residui di PEG liberi o non reagenti rimanenti dal gruppo acetilico, immergere le punte per 30 minuti in una miscela molare 0,65 di quattro parti di anidride acetica e una parte di diisopropiletilamina e N-metil-2-pirrolidone. Quindi immergere in sequenza le punte funzionalizzate con aminoacido peptidico per quattro minuti ciascuna in NMP, cloroformio, etanolo al 50% e acqua prima di asciugare definitivamente la punta all'aria. Fissare la superficie di prova desiderata a un supporto metallico dell'AFM con resina epossidica disponibile in commercio.

Quindi, posizionare il supporto metallico nel supporto di vetro dell'AFM, che ha la forma di una piccola capsula di Petri. Riempire il portabicchieri con il tampone TRIS. E poi posizionare il supporto metallico sul palco AFM sotto il supporto della punta.

Quindi, montare la punta dell'AFM sul vetro ottico dell'AFM. Posizionare il blocco di vetro ottico nella testa AFM. E metti la testa dell'AFM sul palco.

Quindi, calibrare i cantilever AFM con costanti elastiche che vanno da 10 a 30 piconewton per nanometro. Una tipica misurazione della forza si traduce in una curva di distanza della forza come quelle mostrate qui. La prima sbirciatina indica interazioni non specifiche tra la punta e la superficie, mentre la seconda si riferisce all'evento di adesione specifico.

Da diverse centinaia di curve di distanza della forza, è possibile costruire un istogramma tracciando il numero di eventi di adesione rispetto alla forza. L'applicazione di un adattamento gaussiano su questi istogrammi determinerà la forza più probabile. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come modificare chimicamente le punte AFM con amminoacidi o peptidi e come eseguire la spettroscopia di forza a singola molecola utilizzando AFM.