Analisi spazio-temporale di Cytokinetic Eventi in lievito di fissione

L'obiettivo generale di questa tecnica di microscopia su cellule vive è quello di studiare gli eventi spazio-temporali che si verificano durante la citocinesi nel sistema modello di lievito a fissione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo citocinetico, come i dettagli molecolari delle diverse fasi della citocinesi nel tempo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i diversi componenti spaziali del macchinario citocinetico possono essere analizzati per lunghi periodi di tempo con una tossicità minima per le cellule.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla citocinesi e sul lievito di fissione, può essere applicato anche al lievito in erba e ad altri funghi. Per iniziare questa procedura, versare da tre a quattro millilitri di terreno fuso con vitamina C su un piatto di coltura con fondo di vetro. Una volta che il terreno si è solidificato, utilizzare un bisturi affilato per sollevare delicatamente la lastra del terreno dalla piastra di coltura e posizionare la punta di una pipetta tra la lastra del terreno e la piastra di coltura per evitare che la lastra ricada nella piastra.

Successivamente, caricare da due a cinque microlitri di coltura cellulare risospesa tra la lastra del terreno e il fondo di vetro della piastra di coltura. Quindi, rimuovere molto delicatamente il puntale della pipetta e riposizionare la lastra di terreno nella sua posizione originale sul piatto di coltura. Incubare le cellule nella piastra di coltura per 30 minuti o un'ora al buio alla temperatura in cui verrà eseguita la microscopia.

Quando le cellule sono pronte per l'imaging, posizionare una goccia di selvatico sul lato esterno del vetro sul piatto di coltura. Posizionare il piatto di coltura su un microscopio invertito. Concentrati sul piano mediale delle cellule e assicurati che siano ben distanziate e non troppo affollate.

Assicurarsi di avviare l'acquisizione dell'immagine delle cellule in una fase adeguata del ciclo cellulare. In questo esperimento, è il tardo G2. Quindi, programmare il software di acquisizione delle immagini. Impostare il tempo di esposizione per DIC su 100 millisecondi.

Per i filtri GFP e RFP, utilizzare tempi di esposizione di 75 millisecondi. Imposta la potenza del laser al 50%, ma tieni presente che questo varierà a seconda del singolo esperimento. Per acquisire immagini in tre dimensioni, programmare il software per acquisire la serie Z.

Utilizzo di una dimensione massima del passo di 4 micrometri e una distanza di 3,0 micrometri attorno al punto di messa a fuoco centrale delle celle per l'acquisizione di 16 fotogrammi Z per punto temporale per la distanza Z totale di 6 micrometri. Questi parametri possono essere modificati in base allo spessore della cella. Impostare il programma in modo che scatti immagini ogni due minuti.

Seleziona il tempo di esposizione in base ai requisiti dell'esperimento. Nell'esempio vengono utilizzati 75 millisecondi. Programmare il software in modo che interrompa l'acquisizione dopo 90 minuti.

E poi avviare l'acquisizione dell'immagine. Il software ImageJ viene utilizzato per analizzare l'immagine. Per iniziare, apri la serie di immagini per ciascuna delle lunghezze d'onda.

Selezionare una cella da studiare. Fare doppio clic sull'opzione linea della barra degli strumenti per aprire un'altra finestra per regolare la larghezza della linea. Regola la larghezza della linea in modo che corrisponda alla larghezza della cella, che è di circa 40-50 pixel per una cella di tipo selvaggio.

Disegna una linea lungo l'asse lungo della cella di interesse. Fare clic su Analizza, quindi su Strumenti, quindi su ROI Manager e quindi su Aggiungi. In questo modo la riga selezionata verrà aggiunta alla finestra ROI per un uso successivo.

Non chiudere questa finestra. Fare clic sull'immagine di interesse, quindi selezionare modifica, quindi selezionare, quindi raddrizzare. Controllare il processo dell'intera pila per raddrizzare la cella orizzontalmente.

Fare clic sull'immagine, quindi trasformare, quindi ruotare di 90 gradi a destra per raddrizzare l'immagine verticalmente. Fare clic sull'immagine, quindi impilare e quindi creare il montaggio. Si aprirà una finestra per l'assegnazione del numero di righe e colonne per la pila, il fattore di scala per la dimensione dell'immagine, la prima e l'ultima porzione o fotogramma per il montaggio e l'incremento di fotogramma per il montaggio.

Controlla le sezioni dell'etichetta e premi invio. Quando viene visualizzata una finestra con un montaggio della cella di interesse, aprire la serie di immagini per l'altra lunghezza d'onda. Nel gestore ROI, fai clic sull'identificatore di riga per selezionare la stessa cella nel secondo file immagine.

Ripetere i passaggi precedenti per aprire un montaggio della seconda immagine. Nell'immagine con il marcatore del corpo del palo del mandrino, Sad1-mCherry, cerca la separazione del marcatore del corpo del palo del mandrino e contrassegna quel punto temporale come tempo zero. Segui il segnale della proteina ad anello Rlc1-pomodoro sull'immagine nel tempo e cerca il segnale che appare come una linea distinta rispetto alle chiazze di pomodoro Rlc1.

Questo punto temporale segna il completamento dell'assemblaggio dell'anello di actomiosina o l'inizio della fase di maturazione. Quindi, scorri il film nel tempo per determinare quando l'anello di pomodoro Rlc1 inizia a diminuire di dimensioni. Questo è contrassegnato come la fine della fase di maturazione o l'inizio della costrizione dell'anello.

Segui il segnale Rlc1-pomodoro nel tempo durante la costrizione fino a quando non appare come un punto al centro dell'asse cellulare. Questo è contrassegnato come la fine della costrizione dell'anello o la fine dell'ingresso del setto. Dopo il montaggio delle immagini DIC, determinare quando l'abscissione è completata.

Registra il punto temporale in cui le celle si separano fisicamente. Inizia questa analisi selezionando una cellula con un anello di actomiosina visibile. Fare doppio clic sull'opzione linea della barra degli strumenti di ImageJ.

Regolate la larghezza della linea in modo che corrisponda allo spessore dell'anello, da 15 a 20 pixel. Traccia una linea lungo l'anello, facendo attenzione a garantire che l'intero spessore dell'anello sia incluso. Fare clic su Analizza, quindi su Strumenti, quindi su ROI Manager e fare clic su Aggiungi.

In questo modo la riga di selezione verrà aggiunta alla finestra ROI per un uso successivo. Non chiudere questa finestra. Fare clic sull'immagine di interesse e selezionare modifica, quindi selezionare, quindi raddrizzare.

Controllare il processo dell'intera pila per raddrizzare l'anello orizzontalmente. Reimposta l'intensità del piano più luminoso nella pila Z di raddrizzamento utilizzando l'immagine, quindi regola, quindi luminosità e contrasto, quindi ripristina. Fare clic sulla scheda SGK e quindi su Progetto 3D per aprire una finestra di dialogo.

Modificate il metodo di proiezione in punto più luminoso e la spaziatura delle sezioni in due o tre pixel. Infine, modificare l'asse di rotazione sull'asse X o Y a seconda dell'angolo di visione desiderato. Fare clic su interpola e fare clic su OK per generare una proiezione 3D dell'immagine.

Utilizzare la barra di scorrimento sotto l'immagine per ruotare l'immagine. Quindi, apri la serie di immagini per l'altra lunghezza d'onda. Fare clic sull'identificatore di linea nel ROI manager per selezionare lo stesso anello sul secondo file immagine.

Ripetere i passaggi precedenti per aprire un anello 3D nell'immagine con l'altra lunghezza d'onda. Con entrambi gli anelli dell'immagine 3D aperti, fare clic sull'immagine, quindi sul colore, quindi su Unisci i canali. Seleziona ciascuna immagine dal menu a discesa per il colore corrispondente desiderato e fai clic su OK. Confrontare la localizzazione di diversi marcatori per quanto riguarda la localizzazione all'anello citocinetico o alla membrana di ingresso.

Durante la citocinesi sono state visualizzate cellule di lievito di fissione espresse nel marcatore del corpo del polo fuso, Sad1-mCherry e nel marcatore ad anello Rlc1-GFP. La separazione del corpo dell'asta del fuso avveniva a 17 minuti, designata come tempo zero. Rlc1-GFP appare nel sito di divisione quattro minuti prima della separazione del corpo del polo del fuso.

Dopo la separazione del corpo del polo del fuso, la maturazione dell'anello inizia a dieci minuti. La costrizione dell'anello inizia a 31 minuti e termina a 53 minuti. Infine, l'abscissione cellulare avviene a 80 minuti dopo la separazione del corpo del polo del fuso.

La cronologia degli eventi citocinetici determinata nelle immagini precedenti può essere tracciata in un grafico con riferimento alla mitosi determinata dalla distanza tra i marcatori del corpo del polo del fuso. L'analisi del marcatore dell'anello Rlc1-pomodoro e del marcatore della membrana del setto Bgs1-GFP nel sito di divisione durante la citocinesi rivela che l'anello si è assemblato prima del reclutamento di Bgs1-GFP. Quando l'anello si restringe, Bgs1-GFP si localizza anche nella membrana di ingresso adiacente all'anello di costrizione.

Infine, il segnale Rlc1-pomodoro si dissipa dopo la costrizione dell'anello mentre Bgs1-GFP appare come un disco, rimanendo all'interno della barriera di membrana. L'efficienza degli eventi citocinetici può essere determinata dalla distribuzione delle proteine lungo l'anello. Qui la distribuzione di Cdc15-GFP lungo l'anello è uniforme nell'immagine di sinistra ma irregolare nell'immagine di destra.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di scegliere cellule con un campo appropriato, idealmente contenenti da sei a otto cellule ben distanziate in fase G2 o M iniziale, senza impurità visibili nell'agar. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare spaziotemporalmente la localizzazione delle proteine durante la citochinesi.