Sequenza RNA a singola cellula di sottogruppi definiti delle cellule del Ganglio retinico

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare singole cellule marcate in fluorescenza da retine vive a montatura intera. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze. Ad esempio, quanti sottotipi di una particolare classe neuronale esistono e quali sono i marcatori genetici per ciascun sottotipo?

Il vantaggio principale di questa tecnica è che rinunciamo alla necessità di dissociazione del tessuto retinico, consentendo alle cellule di sopravvivere in un ambiente più sano prima dell'isolamento. Le implicazioni di questa tecnica si estendono a qualsiasi popolazione cellulare marcata in fluorescenza e possono quindi essere applicate ad altri sistemi per comprendere la diversità cellulare e la funzione in salute e malattia. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà, perché questa tecnica si basa sulla capacità del ricercatore di applicare un patch clamp a una cellula senza compromettere la vitalità della cellula.

La dimostrazione futura di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di isolamento dell'RNA possono essere difficili da imparare, perché la piccola quantità di RNA può facilmente degradarsi se non gestita correttamente e rapidamente. Per iniziare questa procedura, colpire la cornea con un ago e tagliarla via al bordo della cornea e della sclera. Quindi, rimuovere la lente utilizzando una pinza.

Fai delicatamente una lacerazione nella sclera e recidi il nervo ottico dove la retina e la sclera si incontrano. Termina con cura la rimozione della sclera dalla retina. Quindi, rimuovere il vitreo trasparente.

Tagliare le retine a metà e conservarle nella soluzione extracellulare ossigenata a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. Quando è pronto per montare il tessuto nella camera di registrazione, trasferire un pezzo di retina nella soluzione enzimatica, diluito in 500 microlitri di soluzione extracellulare ossigenata in una capsula di Petri, e incubarlo per due minuti a temperatura ambiente su uno shaker. Successivamente, lavare la retina nella soluzione extracellulare ossigenata e trasferirla in una camera di registrazione con fondo di vetro con una pipetta di trasferimento in plastica.

Successivamente, usa una pinza per appiattire con cura il tessuto con lo strato di fotorecettori rivolto verso il basso. Rimuovere il liquido in eccesso utilizzando una pipetta e ancorare il fazzoletto utilizzando un anello di platino con rete di nylon. Quindi, riempire la camera con la soluzione extracellulare ossigenata e montarla su un tavolino da microscopio.

Perfondere il tessuto con la soluzione extracellulare ossigenata a una velocità compresa tra due e quattro millilitri al minuto. Per prepararsi a questa procedura, pulsare alcune micropipette di vetro per registrazioni elettrofisiologiche utilizzando un estrattore per micropipette. Osservare lo strato di cellule gangliari utilizzando l'ottica IR-DIC.

Quindi, identificare le cellule gangliari GFP plus utilizzando l'epifluorescenza a circa 480 nanometri. Quindi, individuare la pipetta riempita con soluzione intracellulare in DIC. Applicare una leggera pressione positiva e azzerare eventuali offset di tensione sull'amplificatore.

Successivamente, abbassare la micropipetta di vetro su una cella positiva GFP e applicare i passaggi di comando della tensione di prova per monitorare la resistenza di tenuta. La pressione negativa dovrebbe formare una tenuta gigaohm tra la pipetta e la membrana cellulare. Dopo aver formato una tenuta stabile, rompere la membrana applicando brevi impulsi di pressione negativa per ottenere l'accesso all'intera cellula.

Attendere uno o due minuti affinché i dendriti della cellula si riempiano di tracciante fluorescente. In questa fase, estrarre con cautela il contenuto citoplasmatico cellulare nella pipetta applicando una pressione negativa con una siringa da dieci millilitri. Nel frattempo, monitorare l'estrazione in DIC visualizzando il corpo cellulare che diminuisce di dimensioni.

Dopo aver estratto il contenuto citoplasmatico, sollevare con cautela la pipetta dal tessuto e rimuoverla rapidamente dalla soluzione. Quindi, rimuovere rapidamente la pipetta dal supporto dell'headstage e sciacquare brevemente il puntale della pipetta con H2O trattato con DEPC. Quindi, collegare la pipetta a una siringa da un millilitro tramite il tubo a tenuta stagna.

Espellere immediatamente le cellule in dieci microlitri di tampone di lisi, uno nelle provette PCR da 0,2 millilitri. Centrifugare brevemente le provette in una mini centrifuga da tavolo a 2000 volte g per dieci secondi. Successivamente, congelare immediatamente i campioni su ghiaccio secco per cinque minuti.

Dopo il congelamento, conservali a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un massimo di due settimane per ottenere i migliori risultati. Per prepararsi a questa procedura, installare un dispositivo di separazione magnetica fissando con nastro adesivo la parte superiore di un supporto per puntali P20 o P200 rovesciato al supporto magnetico a 96 pozzetti. Quindi, preparare l'etanolo fresco al 70% a circa un millilitro per campione.

Rimuovere le microsfere magnetiche di RNA dalla conservazione a 4 gradi C e scongelarle a temperatura ambiente. Una volta che le perle di RNA sono a temperatura ambiente, agitarle per 30 secondi per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata. Successivamente, scongelare le celle a temperatura ambiente per un minuto.

Quindi, aggiungere cinque microlitri di H2O privo di RNASI a ciascun campione e pipettare su e giù. Successivamente, aggiungere 22 microlitri di perle di RNA a ciascuna provetta e mescolare accuratamente. Incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti per consentire all'RNA di interagire e legarsi con le microsfere magnetiche.

Successivamente, posizionare le provette su un separatore magnetico per otto minuti. Prima di procedere, assicurarsi che il surnatante sia limpido. Osservare le perle da una tavolozza e assicurarsi di non staccarle dal lato della provetta durante il pipettaggio.

Rimuovere il surnatante dai campioni e aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70%. Quindi, rimuovere l'etanolo e ripetere il lavaggio altre due volte. Lasciare asciugare i campioni all'aria per sei minuti.

Controllare a intermittenza se è stato raccolto più etanolo sul fondo del tubo e rimuoverlo di conseguenza. Ricordate che è fondamentale asciugare le perline in modo appropriato. Se le perle non sono abbastanza asciutte, l'etanolo può essere trasportato con l'eluente e diminuirà le rese totali, mentre le perle troppo essiccate possono provocare la perdita di RNA.

Mentre i campioni si asciugano, preparare 10 tamponi di reazione combinando 19 microlitri di tampone di lisi due e un microlitro di inibitore della RNASI. Giralo brevemente verso il basso e tienilo sul ghiaccio. Una volta che i campioni sono asciutti e i pellet di perle non appaiono più lucidi, rimuovere le provette dal separatore magnetico e aggiungere 9,5 microlitri di H2O priva di RNASI per reidratare i campioni.

Quindi, posizionare i campioni sul ghiaccio e aggiungere un microlitro di tampone di reazione 10x a ciascun campione. Questa immagine mostra lo strato di cellule gangliari della retina, visualizzato utilizzando IR-DIC nell'intera preparazione della retina della montatura. La stessa preparazione è stata visualizzata in epifluorescenza a circa 480 nanometri per identificare le cellule gangliari GFP positive.

Questa immagine mostra una cellula positiva alla GFP che è stata destinata alla registrazione del patch-clamp e riempita con un tracciante fluorescente. L'immagine confocale dei dendriti ipRGC riprodotta nella sottolamina on e off dello strato plessiforme interno consente la classificazione di questi tipi di cellule Questo output del bioanalizzatore mostra gli esempi di librerie che sono state sottoposte a trascrizione, amplificazione e purificazione inversa. Le corsie da uno a tre mostrano strisci di DNA ideali, mentre la corsia quattro rappresenta un campione scarsamente elaborato.

La corsia di controllo deve contenere due picchi puliti alle dimensioni del marker di 35 bp e 10380 bp. Ecco una traccia dettagliata di una libreria preparata con successo con un'intensità elevata di circa 2 kb. Anche questa traccia dimostra una preparazione riuscita, ma con lo striscio centrato intorno ai 500 bp.

Questa immagine mostra l'output del bioanalizzatore dopo la marcatura, l'amplificazione e la purificazione dei campioni. La traccia dettagliata di un campione etichettato con successo può essere vista qui, corrispondente al campione nella corsia uno. Una tagmentazione incompleta risulterà in una traccia come quella vista qui, giustificando la ritagmentazione con una nuova diluizione.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare l'RNA dai tipi di cellule marcate in fluorescenza nella retina intatta. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare che l'RNA è molto sensibile alla degradazione e che avere cellule retiniche sane è la chiave. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la qPCR, l'ibridazione NC2 o l'immunoistochimica per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se i geni identificati sono specifici per un determinato sottotipo cellulare. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze, che cercano di comprendere l'eterogeneità dei neuroni in varie regioni del cervello. La comprensione di questa eterogeneità consentirà studi futuri sulla funzione cellulare e la connettività in popolazioni identificate molecolarmente.