Sistema di coltura di organo del grasso corporeo in Aedes Aegypti, vettore di Virus di Zika

Ciao, mi chiamo Immo Hansen, del laboratorio di Fisiologia Molecolare dei Vettori presso la New Mexico State University. Il sistema di coltura del grasso corporeo della zanzara che dimostreremo oggi è un sistema di coltura di organi in vitro che utilizziamo nel nostro laboratorio per studiare la fisiologia e il metabolismo del tessuto corporeo adiposo vivo attaccato alle pareti corporee addominali della zanzara. Il corpo grasso degli insetti è un organo in cui si svolgono molti processi metabolici.

Le sue funzioni rispecchiano quelle del fegato e dei tessuti adiposi dei vertebrati. Abbiamo utilizzato questo sistema per studiare la regolazione della produzione di proteine del tuorlo e i meccanismi di assorbimento dei nutrienti nella zanzara della febbre gialla, Aedis aegypti. Aedi aegypti è un vettore principale di arbovirus come la dengue, la chikungunya e la zika.

Il corpo grasso della zanzara è l'unica fonte di proteine del tuorlo nelle zanzare. Questo protocollo video dimostra un sistema di coltura corporea di grasso di zanzara in vitro e mostra diverse applicazioni sperimentali del sistema. Il protocollo che dimostreremo è composto da più parti.

In primo luogo, prepareremo le soluzioni e i reagenti necessari per il sistema di coltura del corpo grasso. In secondo luogo, eseguiremo dissezioni di zanzare per isolare i corpi adiposi. Quindi, ultima cosa, trasferiremo i corpi adiposi isolati in un terreno arricchito di aminoacidi per attivare la sintesi proteica del tuorlo.

Ci sono diverse applicazioni a valle che possono essere eseguite dopo la coltura del corpo grasso. Oggi eseguiremo la coltura del corpo grasso seguita dal sequenziamento di nuova generazione. Confronteremo due campioni, un campione non stimolato con un campione stimolato con aminoacidi ed ecdisone.

Ulteriori materiali e attrezzature che saranno necessari includono un aspiratore con fiala di raccolta per la raccolta delle zanzare, un cuscinetto antimosche CO2 collegato alla bombola del gas CO2, etanolo per pulire il cuscinetto antimosche, stereomicroscopio con sorgente luminosa, micro forbici per dissezione, pinzette a punta fine e piastre a 96 pozzetti. Per prepararsi alla coltura del corpo grasso, devono essere preparate tre soluzioni madre e reagenti, la soluzione madre amminica, la soluzione madre salina fisiologica Aedes e la soluzione madre di calcio. La soluzione madre fisiologica salina Aedes e la soluzione madre di calcio sono combinate per creare il terreno di coltura del corpo grasso.

Le zanzare utilizzate per questo esperimento dovrebbero avere almeno tre giorni dopo l'emergenza. Utilizzando un aspiratore alimentato a batteria, raccogliere le zanzare in una fiala di raccolta. Posiziona la fiala di raccolta con il campione su un tampone di CO2 per anestetizzare le zanzare.

In alternativa, il ghiaccio può essere utilizzato per anestetizzare le zanzare. Scartare tutti i maschi prima di iniziare le dissezioni. Per prima cosa mettere a fuoco il microscopio da dissezione utilizzando una zanzara di prova per garantire la visibilità.

Una volta messo a fuoco il microscopio, posizionare un vetrino concavo sul microscopio e posizionare due gocce di APS al centro. L'APS aiuta a mantenere la zanzara sollevata e a raccogliere vari organi di zanzara. Seleziona la zanzara con il forcipe, raccogliendola per le zampe.

Togliete le gambe. Mentre tieni la zanzara per il torace con la mano sinistra, usa le altre pinze per afferrare la zanzara per gli ultimi due o tre segmenti dell'addome e tirare delicatamente per rimuoverla. Questa azione dovrebbe rimuovere le ovaie, i tubuli malpighiani, l'intestino posteriore, l'intestino medio e il gozzo.

Una volta rimossi gli organi, usa le forbici a molla per terminare la dissezione del corpo grasso. Inserire una lama nel foro che è stato creato rimuovendo gli ultimi due o tre segmenti dell'addome e tagliare l'addome nel senso della lunghezza fino a raggiungere il segmento sotto il torace. Dopo l'incisione, l'addome dovrebbe espandersi verso l'esterno.

Un'altra incisione viene praticata lateralmente nella parte superiore dell'addome dove è terminata la prima incisione. Dopo le incisioni, l'addome si apre e galleggia con la cuticola rivolta verso l'alto e i corpi adiposi che riposano all'interno dell'APS. Una volta che i corpi adiposi si sono equilibrati sulla soluzione APS per almeno mezz'ora, possono essere trasferiti al terreno di coltura del corpo grasso.

Al fine di stimolare i corpi adiposi a iniziare l'espressione genica della proteina del tuorlo, li trasferiamo in un terreno con alti livelli di aminoacidi liberi e l'ormone steroideo degli insetti, il 20-idrossiecdisone. Una volta trasferiti, i corpi adiposi vengono incubati per sei ore nel terreno. Dopo il periodo di incubazione, i corpi adiposi vengono trasferiti in una provetta Eppendorf con un tampone adatto alle analisi desiderate.

A seconda dell'obiettivo sperimentale, i corpi adiposi possono essere utilizzati in diversi protocolli successivi come qPCR, Western blots, proteomica, metabolomica o RNA-seq. Ad esempio, abbiamo eseguito un esperimento di coltura di corpi adiposi e stimolato corpi adiposi isolati incubandoli su una soluzione contenente una miscela bilanciata di tutti i 20 aminoacidi presenti in natura e l'ormone steroideo insetto 20-idrossiecdisone per sei ore mentre i corpi adiposi di controllo sono stati incubati su un PS per un periodo di tempo uguale. Questa figura mostra i risultati di un'analisi RNA-seq del nostro esperimento.

La mappa di calore indica i livelli di espressione genica di 1256 geni espressi in corpi adiposi in coltura con due diversi trattamenti. Tutti questi geni hanno modificato significativamente i livelli di espressione tra i due trattamenti. Questa tabella mostra i dieci geni più sovraregolati dopo l'attivazione di corpi adiposi in coltura con aminoacidi e 20-idrossiecdisone.

Come previsto, la maggior parte di questi geni sono geni della proteina del tuorlo. Grazie per il tuo interesse per la cultura del corpo grasso di zanzara.