Vieni nel lato di luce: In Vivo monitoraggio di Pseudomonas aeruginosa Biofilm infezioni nelle ferite croniche in un modello murino Hairless diabetico

L'obiettivo generale di questo nuovo modello è quello di consentire il monitoraggio in tempo reale in vivo dell'infezione e della guarigione delle ferite del Biofilm nei topi diabetici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della guarigione delle ferite, come ad esempio quali sono le interazioni alla base delle interazioni tra i biofilm e gli ospiti che soffrono di diabete e il loro impatto nella chiusura. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la progressione del biofilm in vivo e il loro impatto nella guarigione delle ferite possono essere valutati senza dover eseguire l'eutanasia seriale degli animali nel tempo o in momenti specifici.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento, alla terapia o alla diagnosi delle ferite croniche perché il modello può essere utilizzato per testare un'ampia varietà di terapie, tra cui farmaci sistemici e trattamenti topici come le medicazioni antimicrobiche. A dimostrare la procedura saranno Svetlana Navitskaya, un tecnico in un Busik Lab, Cassie Larrivee, una studentessa di master presso la Michigan State University e Sandra O'Reilly, Research Assistant Professor presso MSU. Per indurre il diabete, somministrare cinque iniezioni intraperitoneali giornaliere consecutive di streptozotocina in acido citrico a topi maschi SKH-1 di otto settimane.

14 giorni dopo l'ultima iniezione, utilizzare un glucometro per confermare l'iperglicemia mediante il monitoraggio della glicemia. Delinea cerchi da 10 millimetri su un foglio di silicone spesso 0,5 millimetri, centrando un punzone per biopsia da cinque millimetri al centro di ogni cerchio e premi con decisione il punzone per creare dischi simili a ciambelle che verranno utilizzati come stecche. Usa le forbici per tagliare una medicazione occlusiva trasparente in pezzi di un centimetro alla volta.

Sterilizzare UV i filtri a membrana in policarbonato con una dimensione dei pori di 0,2 micron in una cappa di sicurezza biologica per 15 minuti per lato. Due giorni prima della procedura, inoculare una coltura di P.aeruginosa-Xen41 bioluminescente in brodo di soia triptico per una notte a 37 gradi Celsius e 200 giri/min. La mattina successiva, pellettare le cellule batteriche ed eseguire tre lavaggi in un millilitro di DPBS per lavaggio.

Dopo il terzo lavaggio, diluire la sospensione batterica in DPBS fresco ad un'assorbanza di 05 a 600 nanometri. Posizionare i filtri sterilizzati UV in una piastra di agar di soia triptica e aggiungere 10 microlitri di batteri diluiti su ciascun filtro. Quando le membrane sono asciutte, posizionare la piastra a 37 gradi Celsius, trasferendo i filtri su piastre di agar di soia triptica fresca ogni 24 ore.

Il giorno successivo confermare una mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e pulire la pelle sulla schiena di un animale diabetico SKH-1 con il 10% di iodio povidone e un tampone di isopropanolo. Utilizzando un punzone per biopsia sterile da quattro millimetri, utilizzare un pennarello indelebile per delineare uno schema circolare per la ferita su un lato della linea mediana dell'animale all'altezza della spalla. Successivamente, usa una pinza seghettata per sollevare la pelle al centro del contorno e usa le forbici dell'iride per creare una ferita a tutto spessore che si estende attraverso il tessuto sottocutaneo e include il pannicolo carnoso.

Asportare il pezzo di tessuto circolare e applicare una colla adesiva medica impermeabile sull'animale. Esercitando una leggera pressione, posizionare una stecca di silicone sull'adesivo e tenere premuta la stecca per circa 30 secondi fino a quando la colla non si asciuga. Quindi coprire la ferita con una delle medicazioni occlusive trasparenti, somministrando analgesia una volta al giorno per due giorni tramite iniezione sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio.

Posizionare l'animale nella propria gabbia di recupero. 48 ore dopo l'intervento, utilizzare una spatola sterile per trasferire diversi Biofilm dai loro filtri in una siringa. Quindi utilizzare la siringa per erogare i biofilm in singole provette da microcentrifuga.

Diluire i biofilm in un rapporto di uno a due in DPBS con una breve miscelazione e scomporre ulteriormente l'inoculo di biofilm con due vortici di un minuto intercalati da una sonicazione di due minuti a 40 kilohertz in un detergente non trasonico. Diluire in serie l'inoculo scomposto fino a una volta 10 alla concentrazione di otto negativa per la placcatura e impiattare l'inoculo su piastre di agar di soia triptica. Dopo 24 ore a 37 gradi Celsius, contare i batteri per calcolare le unità formanti colonie di biofilm.

Per valutare il rapporto tra bioluminescenza e conta batterica, effettuare da metà a ventiquattresima diluizione seriale di biofilm in DPBS, agitando le diluizioni fino a produrre sospensioni batteriche visivamente omogenee. Trasferire 200 microlitri di soluzioni diluite in pozzetti individuali di una piastra nera da 96 pozzetti e visualizzare ogni pozzetto utilizzando un sistema di imaging in vivo. Quindi piastra le diluizioni su nuove piastre TSA per un'incubazione di 24 a 37 gradi Celsius, contando le unità formanti colonie il giorno successivo per creare una curva standard della bioluminescenza per la conta spettrale.

Quindi rimuovere il coperchio della medicazione e le stecche di silicone dalle ferite e utilizzare un microscopio con una fotocamera collegata per ottenere micrografie delle ferite. Utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri con un'estremità tagliata, pipettare 10 microlitri di inoculo Biofilm su ciascuna ferita e coprire le ferite con medicazioni fresche. Quindi utilizzare un sistema di imaging in vivo per visualizzare le ferite ogni giorno in una camera di isolamento dotata di un filtro HEPA per valutare la bioluminescenza nelle ferite fino a quando i valori di luminescenza non scendono al di sotto del livello di fondo.

Ottieni immagini e misurazioni giornaliere dell'andamento della chiusura della ferita fino alla guarigione delle ferite. Alcuni vantaggi dell'utilizzo di topi SKH-1 per questo modello di guarigione delle ferite diabetiche sono che i topi non dimostrano una significativa perdita di peso dopo l'induzione del diabete, si verificano meno decessi nella coorte di animali diabetici SKH-1 e gli animali SKH-1 non dimostrano danni cutanei a breve termine o interferenze nella ricrescita dei capelli rispetto ai sei animali neri C 57. L'imaging quotidiano in vivo delle ferite contenenti Biofilm consente di monitorare lo sviluppo dell'infezione e l'evoluzione dei Biofilm.

È quindi possibile generare una curva standard per confrontare la bioluminescenza registrata come flusso totale con la densità batterica all'interno delle ferite. La rimozione della stecca e della medicazione all'ottavo giorno facilita la visualizzazione della guarigione della ferita e la misurazione quotidiana del progresso della chiusura della ferita. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un breve periodo di tempo se eseguita correttamente, riducendo il tempo in cui gli animali sono sotto anestesia.

Seguendo questa procedura, altre condizioni sperimentali come l'uso di diversi microrganismi o le loro combinazioni, nonché l'applicazione di trattamenti, possono essere eseguite per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio il modo in cui i biofilm multispecie influiscono negativamente sulla guarigione delle ferite o quanto bene le ferite rispondono ai nuovi farmaci. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada per consentire ai ricercatori del settore di esplorare l'impatto dei biofilm nella guarigione delle ferite, monitorando la crescita batterica attraverso misurazioni dirette e continue della luminescenza, riducendo al contempo il numero di animali necessari per esperimento. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'intervento chirurgico della ferita e condurre la preparazione del biofilm, l'inoculazione e il protocollo di infezione.