Valutazione della permeabilità della barriera emato - encefalica dall'infusione endovenosa di albumina FITC-labeled in un modello murino di malattia di Neurodegenerative

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la permeabilità della barriera emato-encefalica in un modello murino di malattia degenerativa mediante iniezione intragiugulare di albumina marcata con FITC. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nello studio dell'omeostasi cerebrale. Può essere particolarmente utile indagare su qualsiasi possibile legame tra il danno alla barriera emato-encefalica e la neurodegenerazione.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce e facile da eseguire e può essere applicata, anche, a modelli animali più grandi e ad altri contesti neuro-patologici. A dimostrare la procedura chirurgica di iniezione intragiugulare di FITC-albume sarà Luca Capocci. Salvatore Castaldo dimostrerà il sezionamento istologico di un cervello.

Ed Enrico Amico illustrerà la procedura per l'acquisizione di micrografi. Iniziare preparando la soluzione di FITC-albume sciogliendo la polvere di FITC-albume in soluzione salina tamponata con fosfato a 10 milligrammi per millilitro. Disporre gli strumenti chirurgici autoclavati.

Pulire il banco operatorio con etanolo al 70% e posizionare un telo chirurgico sterile monouso. Quindi impostare lo stereomicroscopio operativo. Dopo aver anestetizzato il topo con un'iniezione intraperitoneale di una dose appropriata di ketamina xilazina, monitorare la sedazione animale dando un leggero pizzicotto delle dita dei piedi e assicurandosi dell'assenza del riflesso di astinenza.

Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina a faccia in su e fissare le quattro zampe e la coda sul banco operatorio con del nastro adesivo. Dopo che il topo è stato fissato, radere accuratamente il margine chirurgico appropriato sul collo e disinfettarlo con una soluzione di iodio povidone in etanolo al 70%. Asciugare la superficie rasata esposta con tamponi di cotone.

Successivamente, dopo aver praticato un'incisione longitudinale lunga 1,5 centimetri nella linea medio-clavicolare, iniziando a metà del torace e estendendosi fino a poco sotto il collo, allungare con cura il tessuto connettivo con una pinza sotto osservazione microscopica per esporre la vena giugulare esterna. Assicurare uno spazio sufficiente a destra e a sinistra della vena giugulare per facilitare l'inserimento dell'ago calibro 30 e mezzo per l'infusione della soluzione di FITC-albume. Iniettare 100 microlitri di 10 milligrammi per millilitro di FITC-albume nella vena giugulare destra in tre minuti.

Questo è il passaggio più critico durante la procedura. L'errato inserimento dell'ago può causare danni irreversibili alla parete venosa e compromettere l'intero esperimento. Quindici minuti dopo l'iniezione, dopo aver soppresso il topo per decapitazione, rimuovere rapidamente il cervello dal cranio e immergerlo in un volume di isopentano pre-raffreddato, cioè dieci volte quello del cervello, per 15 minuti.

Spostare il cervello congelato all'isopentano in una provetta pre-raffreddata e conservarlo in un congelatore a 80 gradi Celsius fino al sezionamento istologico. Incorporare il cervello congelato nel composto a temperatura di taglio ottimale prima del sezionamento del criostato. Tagliare il cervello in sezioni spesse 20 micron con un criostato e montarle su vetrini da microscopio.

Eseguire la co-colorazione FITC-albumina laminina utilizzando un anticorpo anti-laminina specifico, come descritto in precedenza. Coprire i vetrini scivolare con un mezzo di montaggio contenente DAPI e lasciare asciugare il vetrino per una notte a quattro gradi Celsius al buio. Il giorno successivo, osservare la colorazione a fluorescenza con un microscopio a fluorescenza a 20 volte l'ingrandimento, dotato di filtri FITC e Cy3.

Accendere la lampada a fluorescenza circa 10 minuti prima dell'uso. Accendere il microscopio, il computer collegato e la fotocamera digitale. Eseguire il software di analisi delle immagini.

Utilizzare l'obiettivo appropriato per una raccolta ottimale del segnale e una risoluzione spaziale e selezionare i filtri appropriati. Acquisisci un minimo di quattro esposizioni a colori a 24 bit per fetta del cervello. Analizza l'intensità della fluorescenza per ogni singolo canale, utilizzando il software ImageJ disponibile gratuitamente.

Le seguenti micrografie a fluorescenza rappresentative delle criosezioni cerebrali mostrano una distribuzione differenziale dell'albumina fluorescente verde sia in condizioni fisiologiche che patologiche. La colorazione rossa, mostrata qui, rappresenta il marcatore vascolare, la laminina, in condizioni fisiologiche e in condizioni di compromissione della barriera emato-encefalica. Queste immagini unite mostrano la co-localizzazione dell'albumina fluorescente verde e della laminina, insieme alla colorazione DAPI dei nuclei nelle barriere emato-encefaliche intatte e compromesse.

Questo grafico mostra la quantificazione della fluorescenza verde emessa dalla FITC-albumina, che è riportata come intensità di fluorescenza verde sia in condizioni sane che compromesse. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordarsi di preparare ogni singolo reagente e predisporre il banco operatorio. Dopo aver visto questo video, potresti avere una buona comprensione di come valutare la permeabilità della barriera emato-encefalica in un modello animale di malattia neurodegenerativa, misurando l'affissione dell'albumina fluorescente verde nel parenchima cerebrale.