Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere e misurare in modo accurato e riproducibile la saliva del topo dopo la stimolazione con pilocarpina. Misurare la produzione di saliva nei roditori è una procedura impegnativa ed è soggetta a un'elevata variabilità. Questo metodo è semplice e può essere ripetuto sullo stesso animale nei molteplici punti temporali dell'intero studio.

Questo metodo non solo può misurare il volume della saliva prodotta, ma può anche essere utilizzato per raccogliere la saliva per un'ulteriore analisi delle molecole bioattive che possono essere secrete nella saliva. In definitiva, questo sarà di grande utilità quando si studia la sindrome di Sjogren, la fibrosi delle ghiandole salivari o la rigenerazione delle ghiandole salivari in sistemi modello di roditori. Per questa procedura, preparare e congelare aliquote di pilocarpina cloridrato, di non più di tre mesi.

Non ricongelare le aliquote scongelate. Iniziare con la preparazione di provette microfuge da 0,6 ml. Praticare con cura un piccolo foro sul fondo dei tubi con un ago da 18 gauge riscaldato.

Crea un tubo per topo. Quindi, inserire queste provette in provette da 2 mL. La sterilità non è un problema.

Successivamente, utilizzando metodi asettici, tagliare i tamponi assorbenti cilindrici in lunghezze di due centimetri. Quindi, taglia ogni pezzo di due centimetri in diagonale per fare due tamponi di forma conica. Inserire un tampone conico in ciascuna delle provette per microfuge preparate.

Quindi, pesare ogni provetta da 0,6 ml con il tampone asciutto. Ora, trasferisci i topi per lo studio in una nuova gabbia pulita. Possono essere alloggiati insieme.

Per le prossime due ore, dai loro acqua ghiacciata, ma niente cibo. Poco prima della fine del periodo di due ore, preparare la soluzione di pilocarpina di lavoro diluendo un'aliquota di 100x stock in soluzione fisiologica sterile fino a 1x. Agitare il tubo e mantenere la soluzione sul ghiaccio.

Per iniziare, pesare ogni topo per calcolare le dosi. Quindi, anestetizzare i topi con iniezioni intraperitoneali di ketamina più xilazina. Se dopo quattro minuti un topo non viene anestetizzato, regolare il dosaggio.

Ora, applica un unguento talmico su entrambi gli occhi per evitare che si secchi. Successivamente, somministrare la dose calcolata di pilocarpina al topo utilizzando una via intraperitoneale e impostare il timer per due minuti. Durante questo intervallo di due minuti, inserire il mouse in una provetta di contenimento da 50 ml, in modo che solo la testa e le orecchie sporgano verso l'esterno.

Posizionare il tubo con un angolo di 45 gradi, con la testa del mouse rivolta verso il basso e la superficie ventrale rivolta verso l'alto. Quindi, fissare il tubo con del nastro adesivo. Appena trascorsi i due minuti, sollevare la mascella inferiore per aprire la bocca e inserire delicatamente una pinza da dissezione chiusa, uno o due millimetri nella bocca.

Assicurarsi che la lingua sia appoggiata sul braccio superiore della pinza. Con l'altra mano, usa un paio di pinze sottili per tenere il tampone secco pre-pesato vicino alla sua punta conica. Quindi, far scorrere delicatamente la punta conica del tampone in bocca e ritirare la pinza lasciando la punta del tampone nella cavità orale.

Ora, afferra e ruota il tampone fino a quando non raggiunge il massimo contatto con la bocca e in modo che non cada. L'estremità larga del tampone deve rimanere all'esterno della bocca. Tenere il tampone in questa posizione per quindici minuti.

Dopo quindici minuti, ruotare delicatamente il tampone per raccogliere l'eventuale saliva che non è stata assorbita. Quindi, trasferire il tampone imbevuto di saliva nella provetta per microfugo da 0,6 mL. Tappare la provetta e inserirla nella provetta da 2 mL, posta sul ghiaccio.

Ora, trasferisci il mouse in una gabbia di recupero. Fornisci gel dietetico o pellet di cibo inumidito nella gabbia per aiutarla a reidratarsi. Può anche essere somministrata un'iniezione sottocutanea di soluzione salina isotonica da 0,2 ml per accelerare il recupero.

Dopo aver raccolto tutti i campioni di saliva, pesarli per determinare la massa di saliva raccolta. Tagliare i tappi dalle provette da 2 ml contenenti la provetta più piccola di campione di saliva, quindi caricarli in una centrifuga refrigerata e farli girare per due minuti a 7, 500 g e quattro gradi Celsius. La saliva si accumulerà nella provetta da due ml.

Quindi, misurare i volumi dei campioni utilizzando una micropipetta. La produzione di saliva è stata misurata in topi femmina neri C57 di undici settimane utilizzando il metodo descritto. Alla dose di 1 microgrammo di pilocarpina per grammo di peso corporeo, alcuni topi hanno iniziato a mostrare segni di sofferenza.

C'era una buona relazione dose-risposta tra pilocarpina e produzione di saliva. C'era anche una significativa concordanza tra il peso e il volume della saliva. Utilizzando la tecnica descritta, sono state riscontrate differenze di saliva tra i ceppi.

Il ceppo di topi 129 S6 ha prodotto la minor quantità di saliva. In un esperimento per rilevare l'ipofunzione delle ghiandole salivari, sono stati iniettati lipopolisaccaridi per attivare una risposta immunitaria innata. Durante la risposta, i topi hanno prodotto meno saliva.

Un'altra tattica per indurre l'ipofunzione delle ghiandole salivari è stata quella di iniettare nei topi un allume adiuvante più anticorpi anti-Ro52. Il controllo del veicolo è stato trattato solo con Alum. Questo era rilevabile anche con la tecnica descritta.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare in modo accurato e riproducibile la produzione di saliva nei topi. Una volta padroneggiati, dieci topi possono essere valutati in circa due ore e mezza. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere estremamente coerenti in ogni fase, dalle iniezioni intraperitoneali, al posizionamento del tampone e alla gestione degli intervalli di tempo per ogni fase.

Non dimenticare che la pilocarpina cloridrato agisce sul sistema cardiovascolare, causando bradicardia e ipotensione. Pertanto, l'iniezione di pilocarpina nei topi deve essere eseguita con cura.