Name: Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Scopri un metodo accurato per misurare la produzione di saliva nei topi dopo stimolazione con Pilocarpina. Questa tecnica riduce la variabilità e consente studi longitudinali sulla funzione ghiandolare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dal National Institutes of Health, National Institute of Dental e Craniofacial Research (DE025030).

Il protocollo descritto di seguito è stato approvato dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale e segue gli orientamenti etici stabiliti dal National Institutes of Health. Tutti i dati presentati in questo rapporto sono stati generati utilizzando topi femminili che erano 10-12 settimane di età. Sono stati utilizzati i seguenti ceppi di topi: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S e F1 (B6XA/J). Tutti i topi sono stati alloggiati in gabbie di barriera (5 animali per gabbia) in condizioni da organismi patogeni specifiche e forniti di mangime e acqua ad libitum.
1. preparazione
<ol><li>Per preparare una soluzione di cloridrato di pilocarpine, pesare 10 mg del composto e dissolverlo in 1,776 mL di soluzione salina isotonica sterile nel Vortex, per dare una soluzione stock di 5,63 mg/mL. Non c'è nessuna necessità di sterilizzare questa soluzione. Ma se lo si desidera, filtrare attraverso un filtro da 0,2 µM. Conservare questa soluzione madre in diverse aliquote in un congelatore-80 oC per fino a 3 mesi. Ogni azione congelate è per uso singolo. Una volta scongelato, non ricongelare la soluzione pilocarpina.</li>
	<li>Prendere 0,6 mL microfuge tubi e attentamente un pugno un piccolo foro nella parte inferiore di ogni tubo con un ago calibro 18 riscaldato. Impostare questi tubi in provette da 2 mL. I tubi non devono essere sterili.</li>
	<li>Utilizzando una lama di rasoio affilata, sterile, taglio cilindrici tamponcini assorbenti in pezzi di circa 2 cm di lunghezza. Tagliare ogni pezzo di 2 cm in diagonale per dare 2 tamponi a forma conici. Inserire un tampone in ciascuna delle provette microfuge 0,6 mL.</li>
	<li>Pesare il tubo di microfuge 0,6 mL contenente il tampone asciutto.</li>
	<li>Trasferire i topi da studiare in una nuova gabbia pulita con bottiglie d'acqua. Tenere i topi senza cibo per almeno 2 h prima dell'inizio della raccolta della saliva per impedire la contaminazione di saliva raccolta le particelle di cibo. Nota: Non è necessario mantenere 1 mouse per gabbia per questa procedura. Tuttavia, il numero dei topi collocati in ogni gabbia dipende dell'istituzione specifiche norme e regolamenti per uso animale.</li>
	<li>Poco prima della fine di 2 h, preparare la soluzione di lavoro pilocarpina (0,0563 mg/mL) diluendo la soluzione di riserva 100 x in soluzione fisiologica sterile. Non è necessario filtrare ulteriormente sterilizzare questa soluzione. Tenere sempre la soluzione di Pilocarpina lavoro sul ghiaccio. Nota: La tabella 1 fornisce la quantità di Pilocarpina deve essere iniettato per una gamma di pesi corporei del mouse per dare una dose finale di 0,375 mg/kg di peso corporeo.</li>
</ol>2. la procedura
<ol><li>Pesare ogni mouse e determinare la dose di anestetico mix per ogni mouse utilizzando la tabella 1. Iniettare il primo mouse con il volume appropriato della miscela anestetica per via intraperitoneale. Impostare il timer per 2 min (la maggior parte dei ceppi murini testati in questo protocollo andare a dormire da 2 min). Assicurarsi che il mouse è adeguatamente anestetizzato dalla mancanza di camminare quando appoggiata su una superficie piana. Se il mouse è ancora a piedi, attendere per ulteriori 2 min prima di procedere al passaggio successivo. Applicare una goccia di lubrificante unguento oftalmico in entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione. Nota: Nella tabella 1, la dose della miscela anestetica è peso corporeo 0,007 mL/g. La gamma ottimale per questa procedura è 0,006 a 0,008 mL/g di peso corporeo. Tuttavia, dopo 4 min, se il mouse è ancora a piedi o che esibiscono i movimenti a scatti, consultare il veterinario istituzionale per aumentare opportunamente la dose di anestetico.</li>
	<li>Determinare la dose di Pilocarpina per il mouse utilizzando la tabella 1 e iniettare la giusta quantità per via intraperitoneale. Impostare il timer per 2 min e inserire il tubo di guida 50 mL il mouse fino a quando la testa e le orecchie bastone fuori alla fine taglio. Posizionare il tubo ad un angolo di 45 gradi, con la testa in giù e la superficie ventrale rivolta verso l'alto. Nastro il tubo alla scheda procedura per impediscono di muoversi. Nota: La tabella 1 fornisce il dosaggio per topi più di 17 g, come questa procedura non è stata tentata su topi pesatura sotto 17 g.</li>
	<li>Alla fine di 2 min, delicatamente inserire un paio di micro forcipe di dissezione in bocca chiusi e sollevare la mascella inferiore verso l'alto per aprire la bocca. Spingere il forcipe 1-2mm ulteriormente nella bocca, assicurandosi che la linguetta è visto che riposa sul braccio superiore della pinza. Con un altro paio di una pinzetta, tenere il tampone asciutto pre-pesato vicino alla sua punta conica.</li>
	<li>Far scorrere delicatamente la punta conica del tampone in bocca. Ritirare il forcipe, lasciando la punta del tampone nella cavità orale.</li>
	<li>Afferrare l'estremità più larga del tampone che si estende di fuori della bocca e ruotarlo per consentire la massima superficie di contatto con la bocca. Tenere il tampone in questa posizione per 15 min. Nota: Questo assicura che il tampone rimane in bocca per tutta la durata della raccolta. Nota che la punta conica del tampone funge da uno stoppino e la parte più ampia del tampone rimane fuori della bocca.</li>
	<li>Alla fine di 15 min, delicatamente ruotare il tampone per raccogliere qualsiasi saliva che non è stata assorbita e inserire il tampone bagnato nel tubo microfuge 0,6 mL. Tappare la provetta e impostarlo nel tubo 2ml posizionato su ghiaccio. Nota: In questo momento, la mucosa orale apparirà completamente asciutto. Il mouse può ora essere spostato indietro nella sua gabbia per il recupero dall'anestesia.</li>
	<li>Trasferire il mouse nella gabbia. Posto inumidito pellet cibo nella gabbia dopo il prelievo della saliva per aiutare più veloce reidratazione. Nota: I topi si sveglia entro 10 min dopo la fine della raccolta. L'iniezione sottocutanea di 0,2 mL di soluzione salina isotonica pre-riscaldato può anche essere somministrato per accelerare il recupero.</li>
	<li>Procedere al prossimo mouse. Tutti i topi devono essere monitorati fino a quando completamente hanno recuperato e sono ambulatoria.</li>
</ol>3. misurazioni
<ol><li>Alla fine di tutte le collezioni, pesare i tubi di 0,6 mL con il tampone bagnato. Calcolare la differenza tra il peso bagnato e il peso a secco per ottenere il peso della saliva prodotta. Posizionare il tubo di 0,6 mL con la saliva nuovamente dentro il tubo di 2 mL.</li>
	<li>Tagliare i tappi delle provette 2 ml. Quindi, centrifugare le provette 2 mL per 2 min a 7500 x g, a 4oC in una centrifuga micro per recuperare la saliva. Misurare il volume di saliva ottenuto utilizzando una micropipetta.</li>
	<li>Esprimere i risultati come saliva peso (mg)10 oltre 15 min o come un rapporto tra peso saliva (mg) / mouse peso corporeo (g). Nota: Se il volume di saliva estratta fuori il tampone è stato misurato, esprimere i risultati come il volume di saliva recuperato (mL) o il rapporto di saliva volume (mL) / mouse peso corporeo (g).</li>
</ol>

<ol><li>Proctor, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+salivary+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol+2000%22%5BJournal%5D)">The physiology of salivary secretion.</a> Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).</li>
<li>Fox, R. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16039337">Sjögren's syndrome.</a> Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).</li>
<li>Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xerostomia+and+its+predictors+following+parotid-sparing+irradiation+of+head-and-neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).</li>
<li>Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+secretion+rates+from+mouse+and+rat+parotid+glands+are+markedly+different+following+pilocarpine+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation.</a> Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).</li>
<li>Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+short-term+gamma-irradiation+effects+on+mouse+salivary+gland+function+using+a+new+saliva+collection+device%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device.</a> Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).</li>
<li>Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+short+peptides+from+the+60-kDa+Ro+antigen+recapitulates+the+serological+and+pathological+findings+as+well+as+the+salivary+gland+dysfunction+of+Sjogren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome.</a> J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).</li>
<li>Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+through+Toll-like+receptor+3+causes+a+rapid+loss+of+salivary+gland+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Pathol+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function.</a> J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).</li>
<li>Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+stimuli+accelerate+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome-like+disease+in+%28NZB+x+NZW%29F1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice.</a> Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).</li>
<li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+innate+immunity+and+Ro52-induced+antibody+causes+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome-like+disorder+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice.</a> Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).</li>
<li>Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+muscarinic+receptors+signal+pilocarpine-induced+salivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation.</a> J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).</li>
<li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+elevation+and+secretion+of+interleukin-1beta+in+the+submandibular+gland+of+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice.</a> Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).</li>
<li>Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+isoflurane+anesthesia+and+pilocarpine+on+rat+parotid+saliva+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow.</a> Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).</li>
<li>Kohrs, R., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine%3A+teaching+an+old+drug+new+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Ketamine: teaching an old drug new tricks.</a> Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/">http://cshprotocols.cshlp.org/</a> (2006).</li>
<li>Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+saliva+collection+using+cotton+swab+on+cortisol+enzyme+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay.</a> Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

La produzione di saliva è un processo complesso ed è influenzata da molti fattori. Di conseguenza, la funzione della ghiandola salivaria in animali da laboratorio di misura può essere una sfida. Un'ulteriore sfida è che le misurazioni ripetute della funzione della ghiandola salivaria nello stesso animale sono necessari per stabilire l'inizio della malattia o per dimostrare il recupero dopo il trattamento.
Il metodo tampone descritto in questo rapporto è tecnicamente semplice da eseguire con di...

Le ghiandole salivari producono la saliva in risposta ad una varietà di stimoli neurologici e meccaniche1. Gli stimoli sono trasportati attraverso il sistema nervoso simpatico e parasimpatico ai recettori adrenergici e colinergici nella ghiandola. Pilocarpina è un agente colinergico, para-simpaticomimetici che agisce prevalentemente sui recettori muscarinici. Nella ghiandola salivaria, induce la produzione di saliva, agendo sui recettori muscarinici M31. Produzione di saliva dopo somministrazione di Pilocarpina è un indicatore della capacità di rispondere alla stimolazione delle ghiandole salivarie ed è comunemente usata come misura della funzione della ghiandola salivaria.
Misurazione precisa della produzione di saliva è fondamentale nello studio delle malattie della ghiandola salivare, tra cui la sindrome di Sjögren2 e ferita di radiazione che segue la testa e del collo cancro trattamento3. Diversi metodi sono stati sviluppati per misurare la produzione di saliva nei roditori. Questi includono diretto inserimento di una canula del dotto escretore salivario4, la raccolta di saliva dalla cavità orale sotto vuoto5e insieme utilizzando vetro capillari6 o una micropipetta7,8, 9. dirigere l'incannulamento del dotto salivare fornisce saliva più accurata e pura. Tuttavia, questa è una procedura tecnicamente impegnativa e il potenziale per causare lesioni ductal preclude collezioni ripetitivo saliva dall'animale stesso. Raccolta della saliva sotto vuoto può portare a risultati variabili dovuto essiccamento della saliva dal tubo. Questa perdita è esagerata ulteriormente in topi con ridotta salivazione. Tubi capillari in vetro permettono la raccolta di saliva per analisi successive, tuttavia, cambiamenti nella viscosità della saliva secreta nello stato malato previene efficiente riempimento del capillare. Inoltre, tentativi di spazzare la cavità orale per raccogliere i residui della saliva possono provocare lesioni. Il metodo di dispensare consente per la collezione completa, e per lo stesso operatore, è notevolmente coerente tra esperimenti. Tuttavia, per ragioni sconosciute, questo metodo Mostra una variazione significativa tra operatori diversi. Pertanto, per consentire paragoni adeguati, diventa imperativo che l'operatore stesso esegue tutti gli esperimenti relazionati a un progetto specifico. Chiaramente, questo rappresenta un grande svantaggio per un laboratorio.
Per superare questi problemi, è stata sviluppata una procedura che combina saliva raccolta metodi usati per gli esseri umani e roditori. Il metodo tampone, descritto di seguito per misurare il volume di saliva indotti da pilocarpina è semplice, riproducibile, non influenzato da parte dell'operatore e può essere eseguito più volte nello stesso animale. Inoltre, permette la raccolta di saliva per successive analisi di proteine, immunoglobuline o altre biomolecole.

<table><tbody><tr><td>Sostanze chimiche per la raccolta della saliva</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pilocarpina cloridrato</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td><td>B21410</td><td>Diluire in soluzione salina isotonica sterile. Conservare le aliquote monouso di 100X a -80oC</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anesthesia Mix solution</td><td></td><td></td><td>Mix 1 mL di ketamina cloridrato + 0,5 mL di xilazina + 8,5 mL di soluzione salina isotonica sterile in una fiala sterile. Può essere utilizzato per 3 mesi.</td></tr><tr><td>Zetamina (ketamina cloridrato)</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>C3N VT1</td><td>Stock è 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Anased (xilazina)</td><td>Med-Vet International, Mettawa, IL,</td><td>USA RXANASED-20</td><td>Stock è 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Soluzione salina isotonica sterile</td><td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td><td>501032</td><td>Usato come diluente</td></tr><tr><td>Lacrime artificiali (lubrificante unguento oftalmico)</td><td>Henry Schien, Dublino, OH, USA</td><td>48272</td><td>Utilizzato per prevenire la secchezza degli occhi durante la procedura</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materiali per la raccolta della saliva</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SalivaBio Tampone per bambini</td><td>Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA</td><td>N/A</td><td>Tamponi confezionati singolarmente Provette</td></tr><tr><td>in polipropilene da 50 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89004-364</td><td>Tagliare il fondo di 1 cm della provetta. Assicurarsi che il bordo tagliato sia liscio.</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga 0,6 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-290</td><td>Praticare dei fori sul fondo della provetta con aghi riscaldati da 18 gauge</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga 2 mL</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe per insulina con aghi fissati in modo permanente</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>aghi smussati regolari calibro 18</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi sterile #11</td><td>Integra York Inc PA, USA</td><td>4-311</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per microdissezione</td><td>Roboz, Gaithersburg, MD, USA</td><td>RS-5139</td><td>Punta angolare seghettata da 0,8 mm, lunghezza 4"</td></tr><tr><td>Nastro per etichette</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA</td><td>sc-224487</td><td></td></tr><tr><td>Timer a 3</td><td>canali Amazon.com, Seattle, WA, USA</td><td>B06W2KCYVN</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Mettler Toledo, Columbus OH, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sostanze chimiche/ reagenti per indurre disfunzione salivare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Invivogen, San Deigo, CA, USA</td><td>tlrl-b5lps</td><td>Sciogliere in acqua priva di endotossine e conservare la soluzione madre a 5 mg/mL . diluire in HBSS sterile 100 ug/mL - iniettare 100 uL/ moue ip</td></tr><tr><td>Imject Alum adiuvante</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td>Diluire 1:1 in soluzione fisiologica sterile. Iniettare per via intraperitoneale 0,1 mL/topo</td></tr><tr><td>Antisiero anti-Ro52 di coniglio</td><td>Generato in laboratorio</td><td></td><td>Immunizzazione di conigli con topo ricombinante Ro52</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals/ Kit per analisi della saliva</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stima del lisozima salivare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnzChek Lysozyme Assay</td><td>Kit Molecular Probes, Eugene, OR, USA</td><td>E-22013</td><td>Utilizzato secondo le istruzioni del produttore</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments </td></tr><tr><td>Stima delle IgA salivari mediante ELISA a sandwich</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgA di topo</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>0106-01</td><td>Standard per ELISA a sandwich - intervallo da 30 ng/mL a 0,5 ng/mL IgA</td></tr><tr><td>anti-topo di capra non marcato</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-01</td><td>Rivestimento a 1 ug/mL in tampone di bicarbonato</td></tr><tr><td>IgA anti-topo di capra HRP</td><td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td><td>1040-05</td><td>Anticorpo di rilevamento utilizzato a diluizione 1:4000</td></tr><tr><td>Substrato TMB</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>555214</td><td>Utilizzato secondo le istruzioni del produttore</td></tr><tr><td>Immulon 4HBX Microtiter 96 piastre a pozzetti</td><td>Thermo Scientific, Rochester, NY, USA</td><td>3855<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Stima delle proteine salivari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate BioRad</td><td>, Hercules, CA, USA</td><td>5000006</td><td>Per la stima delle proteine secondo le istruzioni del produttore</td></tr></tbody></table>

un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

I pazienti con la sindrome di Sjögren, una malattia autoimmune che interessa le ghiandole esocrine, sviluppano l'infiammazione della ghiandola salivaria e hanno ridotto la produzione di saliva. Analogamente, la produzione di saliva è gravemente compromesso in pazienti che ricevono radioterapia per i tumori testa e collo. Modelli del roditore, sviluppati per simulare queste condizioni cliniche, facilitano la comprensione della patogenesi della malattia e consentono lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Pertanto, la capacità di accurata, riproducibile e ripetutamente misurare la funzione della ghiandola salivaria in modelli animali è fondamentale. Sulla base di procedure precedentemente descritte in letteratura, è stato sviluppato un metodo che soddisfa questi criteri ed è stato usato per valutare la funzione della ghiandola salivaria in topi. Un ulteriore vantaggio di questo nuovo metodo è che è facilmente imparato e ha poca variazione inter-operatore. Funzione della ghiandola salivaria è valutata come la quantità (peso o volume) o velocità (mL/min) di saliva prodotta in risposta alla stimolazione di pilocarpina. La saliva raccolta è una buona fonte per le analisi del contenuto proteico, le concentrazioni nell'immunoglobulina e altre biomolecole.

Nei sistemi modello sperimentale del topo, la capacità di produrre saliva in risposta alla stimolazione di Pilocarpina è usata come un indicatore della funzione della ghiandola salivaria. La produzione di saliva è stata misurata in 11-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6 il metodo tampone. In Figura 1A, i risultati sono espressi come la quantità di saliva (mg) raccolta seguendo le dosi aumentanti di pilocarpina. Alla dose di 1 mg/kg di peso corporeo, alcun...

Ipofunzione della ghiandola salivaria è una frequente conseguenza di autoimmune malattia e radioterapia. Riproducibile valutazione della funzione della ghiandola salivaria in modelli murini di queste malattie è una sfida tecnica. Qui, è descritto un metodo semplice per la misurazione accurata e riproducibile della produzione di saliva nei topi.

Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere e misurare in modo accurato e riproducibile la saliva del topo dopo la stimolazione con pilocarpina. Misurare la produzione di saliva nei roditori è una procedura impegnativa ed è soggetta a un'elevata variabilità. Questo metodo è semplice e può essere ripetuto sullo stesso animale nei molteplici punti temporali dell'intero studio.Questo metodo non solo può misurare il volume della saliva prodotta, ma può anche essere utilizzato per raccogliere la saliva per un'ulteriore analisi delle molecole bioattive che possono essere secrete nella saliva. In definitiva, questo sarà di grande utilità quando si studia la sindrome di Sjogren, la fibrosi delle ghiandole salivari o la rigenerazione delle ghiandole salivari in sistemi modello di roditori. Per questa procedura, preparare e congelare aliquote di pilocarpina cloridrato, di non più di tre mesi.Non ricongelare le aliquote scongelate. Iniziare con la preparazione di provette microfuge da 0,6 ml. Praticare con cura un piccolo foro sul fondo dei tubi con un ago da 18 gauge riscaldato.Crea un tubo per topo. Quindi, inserire queste provette in provette da 2 mL. La sterilità non è un problema.Successivamente, utilizzando metodi asettici, tagliare i tamponi assorbenti cilindrici in lunghezze di due centimetri. Quindi, taglia ogni pezzo di due centimetri in diagonale per fare due tamponi di forma conica. Inserire un tampone conico in ciascuna delle provette per microfuge preparate.Quindi, pesare ogni provetta da 0,6 ml con il tampone asciutto. Ora, trasferisci i topi per lo studio in una nuova gabbia pulita. Possono essere alloggiati insieme.Per le prossime due ore, dai loro acqua ghiacciata, ma niente cibo. Poco prima della fine del periodo di due ore, preparare la soluzione di pilocarpina di lavoro diluendo un'aliquota di 100x stock in soluzione fisiologica sterile fino a 1x. Agitare il tubo e mantenere la soluzione sul ghiaccio.Per iniziare, pesare ogni topo per calcolare le dosi. Quindi, anestetizzare i topi con iniezioni intraperitoneali di ketamina più xilazina. Se dopo quattro minuti un topo non viene anestetizzato, regolare il dosaggio.Ora, applica un unguento talmico su entrambi gli occhi per evitare che si secchi. Successivamente, somministrare la dose calcolata di pilocarpina al topo utilizzando una via intraperitoneale e impostare il timer per due minuti. Durante questo intervallo di due minuti, inserire il mouse in una provetta di contenimento da 50 ml, in modo che solo la testa e le orecchie sporgano verso l'esterno.Posizionare il tubo con un angolo di 45 gradi, con la testa del mouse rivolta verso il basso e la superficie ventrale rivolta verso l'alto. Quindi, fissare il tubo con del nastro adesivo. Appena trascorsi i due minuti, sollevare la mascella inferiore per aprire la bocca e inserire delicatamente una pinza da dissezione chiusa, uno o due millimetri nella bocca.Assicurarsi che la lingua sia appoggiata sul braccio superiore della pinza. Con l'altra mano, usa un paio di pinze sottili per tenere il tampone secco pre-pesato vicino alla sua punta conica. Quindi, far scorrere delicatamente la punta conica del tampone in bocca e ritirare la pinza lasciando la punta del tampone nella cavità orale.Ora, afferra e ruota il tampone fino a quando non raggiunge il massimo contatto con la bocca e in modo che non cada. L'estremità larga del tampone deve rimanere all'esterno della bocca. Tenere il tampone in questa posizione per quindici minuti.Dopo quindici minuti, ruotare delicatamente il tampone per raccogliere l'eventuale saliva che non è stata assorbita. Quindi, trasferire il tampone imbevuto di saliva nella provetta per microfugo da 0,6 mL. Tappare la provetta e inserirla nella provetta da 2 mL, posta sul ghiaccio.Ora, trasferisci il mouse in una gabbia di recupero. Fornisci gel dietetico o pellet di cibo inumidito nella gabbia per aiutarla a reidratarsi. Può anche essere somministrata un'iniezione sottocutanea di soluzione salina isotonica da 0,2 ml per accelerare il recupero.Dopo aver raccolto tutti i campioni di saliva, pesarli per determinare la massa di saliva raccolta. Tagliare i tappi dalle provette da 2 ml contenenti la provetta più piccola di campione di saliva, quindi caricarli in una centrifuga refrigerata e farli girare per due minuti a 7, 500 g e quattro gradi Celsius. La saliva si accumulerà nella provetta da due ml.Quindi, misurare i volumi dei campioni utilizzando una micropipetta. La produzione di saliva è stata misurata in topi femmina neri C57 di undici settimane utilizzando il metodo descritto. Alla dose di 1 microgrammo di pilocarpina per grammo di peso corporeo, alcuni topi hanno iniziato a mostrare segni di sofferenza.C'era una buona relazione dose-risposta tra pilocarpina e produzione di saliva. C'era anche una significativa concordanza tra il peso e il volume della saliva. Utilizzando la tecnica descritta, sono state riscontrate differenze di saliva tra i ceppi.Il ceppo di topi 129 S6 ha prodotto la minor quantità di saliva. In un esperimento per rilevare l'ipofunzione delle ghiandole salivari, sono stati iniettati lipopolisaccaridi per attivare una risposta immunitaria innata. Durante la risposta, i topi hanno prodotto meno saliva.Un'altra tattica per indurre l'ipofunzione delle ghiandole salivari è stata quella di iniettare nei topi un allume adiuvante più anticorpi anti-Ro52. Il controllo del veicolo è stato trattato solo con Alum. Questo era rilevabile anche con la tecnica descritta.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare in modo accurato e riproducibile la produzione di saliva nei topi. Una volta padroneggiati, dieci topi possono essere valutati in circa due ore e mezza. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere estremamente coerenti in ogni fase, dalle iniezioni intraperitoneali, al posizionamento del tampone e alla gestione degli intervalli di tempo per ogni fase.Non dimenticare che la pilocarpina cloridrato agisce sul sistema cardiovascolare, causando bradicardia e ipotensione. Pertanto, l'iniezione di pilocarpina nei topi deve essere eseguita con cura.

a-method-for-the-measurement-of-salivary-gland-function-in-mice

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Ripetute misurazioni della fisiologia respiratoria e roditori di campionamento di cellule infiammatorie delle vie aeree sono auspicabili, ma generalmente non realizzabili. Qui si descrive un metodo ripetibile per l'intubazione per via orale nei topi che permette misurazioni ripetute di iperreattività delle vie aeree e il campionamento di cellule infiammatorie delle vie aeree.

Un reversibile, metodo non invasivo per le misure di resistenza delle vie aeree e liquido di lavaggio broncoalveolare di campionamento nei topi

Un protocollo ottimizzato per l'isolamento di cellule staminali dalla ghiandola salivare del mouse è descritto. Il metodo impiega digestione enzimatica e meccanica, e permette l'isolamento di salispheres contenenti cellule con caratteristiche di cellule staminali.

Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Questo metodo viene illustrato come analizzare e valutare lo sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione da topi. Escisse ghiandole mammarie sono valutati per il grado di sviluppo utilizzando montare tutto mentre emissione del latte viene valutata utilizzando un ossitocina a base di test contrazione delle cellule mioepiteliali.

Valutazione dello Sviluppo ghiandola mammaria e funzione in modelli murini

Un protocollo per l'incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il dotto di Wharton è descritto. Per questo esperimento, la soluzione trypan blu è usato come un tintore per dimostrare quanto questa tecnica offre efficacemente infusi nella ghiandola mirati, e di suggerire l'affidabilità di questo nuovo approccio clinico come un potenziale farmaco / terapia cellulare per la rigenerazione delle ghiandole salivari.

Incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il Duct Wharton

La microscopia intravitale è un potente strumento che permette l'imaging vari processi biologici di animali vivi. In questo articolo, presentiamo un metodo dettagliato per l'imaging la dinamica di strutture subcellulari, come granuli secretori, nelle ghiandole salivari di topi vivi.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Descriviamo un protocollo per esporre chirurgicamente e di stabilizzare la ghiandola salivare sottomandibolare murina per videomicroscopia imaging utilizzando la microscopia intravital in posizione verticale. Questo protocollo è facilmente adattabile ad altre ghiandole esocrine della testa e collo regione dei topi e altri piccoli roditori.

Preparazione della ghiandola salivare sottomandibolare murino per microscopia Intravital verticale

Vi presentiamo un approccio dettagliato dell'esecuzione di raccolta della saliva, compreso il tracheostomy murino ed all'isolamento di tre ghiandole salivari maggiori.

Valutazione funzionale salivare murina attraverso dopo stimolazione Pilocarpina frazionato radiazione

Nel presente protocollo, la funzione di barriera endoteliale della ghiandola sottomandibolare (SMG) è stata valutata iniettando diversi traccianti fluorescenti pesati molecolari nelle vene angolari di modelli animali in vivo sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni.

In vivo Rilevamento della permeabilità vascolare nella ghiandola sottomandibolare del topo

L'imaging immunofluorescente è limitato dalla capacità di osservare processi biologici complessi e dipendenti dal tempo in una singola istantanea nel tempo. Questo studio delinea un approccio di imaging dal vivo condotto su fette di ghiandola sottomandibolare di topo tagliate con precisione. Questo approccio consente l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellula-cellula durante l'omeostasi e i processi di rigenerazione e riparazione.

Interrogazione delle interazioni cellula-cellula nella ghiandola salivare tramite imaging di cellule vive ex vivo

Qui, descriviamo la somministrazione di farmaci guidata da micropipette (MDA) come un metodo alternativo alla sonda gastrica orale che incentiva l'animale da ricerca a ingerire prontamente i trattamenti con il minimo stress e disagio.

Uso della somministrazione di farmaci guidata da micropipette come metodo alternativo alla sonda gastrica orale nei modelli di roditori

Qui, descriviamo la misurazione della tosse utilizzando un sistema di pletismografia di tutto il corpo (WBP) non invasivo e in tempo reale e le procedure normative per la raccolta di campioni di tessuto di topi e introduciamo alcuni metodi per valutare l'infiammazione delle vie aeree.

Metodi per rilevare la tosse e l'infiammazione delle vie aeree nei topi

Scopri un metodo accurato per misurare la produzione di saliva nei topi dopo stimolazione con Pilocarpina. Questa tecnica riduce la variabilità e consente studi longitudinali sulla funzione ghiandolare.

Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

Esplora altri video