Name: Levator Auris Longus Preparazione per lesame della trasmissione neuromuscolare dei mammiferi sotto condizioni di morsetto di tensione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Impara a isolare il muscolo levator auris longus del topo per registrare correnti sinaptiche alla giunzione neuromuscolare. Questo metodo elettrofisiologico consente di studiare la trasmissione sinaptica in condizioni normali e patologiche.

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Si ringraziano il Dr. Mark M. Rich e Daniel Miranda per Commenti editoriali, Ahmad Khedraki per aiutare a stabilire questa tecnica e Wright State University per il sostegno finanziario (fondo di avvio per A.A.V.).

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

È descritto qui la preparazione e l'uso del mouse del muscolo LAL per la misura della trasmissione neuromuscolare in condizioni di corrente o tensione morsetto. Ci sono diversi punti importanti da considerare per la dissezione fuori il LAL. Pulizia del tessuto connettivo in eccesso l'AIDS di muscolo in impalamento elettrodo, come gli elettrodi riesci a scroccare il tessuto connettivo quando loro posizionamento per impalamento. Tuttavia, rimuovere solo il tessuto connettivo che può essere tolto facilmente per limitare le ...

Studiando la trasmissione sinaptica alla giunzione neuromuscolare fornisce approfondimenti il rapporto dinamico tra i sistemi nervosi e scheletrici muscolari ed è un eccellente modello per l'esame di fisiologia sinaptica. Il levator auris longus (LAL) è un muscolo sottile, permettendo per le giunzioni neuromuscolari possano essere facilmente visualizzati. Rapporti precedenti hanno descritto la convenienza di usando il LAL per esaminare le tossine e droghe sinaptiche e hanno caratterizzato le caratteristiche del tipo di fibra muscolare scheletrica del leone1,2. Numerosi studi hanno utilizzato la LAL per esaminare la fisiologia neuromuscolare3,4,5,6,7,8. Per elettrofisiologia, la capacità di osservare facilmente giunzioni neuromuscolari LAL consente il posizionamento accurato dei microelettrodi presso il terminale del motoneurone e riduce notevolmente i problemi di spazio morsetto in registrazione trasmissione sinaptica. Corrente-morsetto registrazioni delle proprietà di membrana del muscolo, come la costante di tempo della membrana (τm) e la resistenza di ingresso (Ra) sono facilmente ottenute. Inoltre, queste proprietà possono essere misurate da fibre del muscolo stesse utilizzate per registrare la trasmissione neuromuscolare, consentendo un confronto diretto della funzione sinaptica per le proprietà della membrana muscolare. Analisi di questi dati può fornire spunti preziosi per i meccanismi fisici di molte malattie neuromuscolari e Stati di attività alterata.
Un aspetto fondamentale della tecnica qui descritta è l'uso di tensione-morsetto per registrazioni sinaptiche, che non sono soggetti alla non-linearità incontrate nella corrente-morsetto e sono indipendenti le proprietà della membrana muscolare. Vantaggi dell'utilizzo di tensione-morsetto al contrario di corrente-morsetto per esaminare la trasmissione neuromuscolare sono stati stabiliti dai pionieristici sforzi nel 1950s9. Sotto corrente-pinza, EPPs che superano i 10-15 mV in ampiezza non sono un prodotto lineare della ampiezza mEPP9. Ad esempio, se la media mEPP è 1 mV, un PPE di 5 mV può presumere di essere il prodotto di 5 mEPPs (QC di 5); considerando che, un PPE di 40 mV sarà il prodotto di più di 40 mEPPs. Questa non-linearità alle più grandi EPPs si verifica perché la forza motrice per il PPE, che è la differenza tra il potenziale di membrana e il potenziale di equilibrio per il recettore dell'acetilcolina (~ -10 mV), sostanzialmente diminuisce durante grande EPPs. Questo problema è evitato in esperimenti di tensione-clamp perché il potenziale di membrana muscolare non cambia durante gli esperimenti di tensione-morsetto. Uno svantaggio è che esperimenti di tensione-clamp sono tecnicamente più difficili rispetto a quello che di registrazione corrente-morsetto. Con questo in mente, McLachlan e Martin ha sviluppato una semplice correzione matematica che rappresenta il non-linearità in corrente-morsetto registrazioni di EPPs10. Le correzioni funzionano bene11,12,13, ma la cosa importante, si supponga che le proprietà della membrana muscolare non sono stati interrotti.
Le proprietà della membrana muscolare sono particolarmente importante considerare se studiando condizioni o Stati di malattia che interrompono il muscolo. Ad esempio, il muscolo scheletrico da R6/2 modello transgenico della malattia di Huntington è hyperexcitable a causa di una progressiva riduzione nel riposo cloruro e potassio correnti14,15. Di conseguenza, mEPPs ed EPPs sono amplificati nel muscolo scheletrico R6/2. Certamente, i fattori supplementari possono alterare mEPPs ed EPPs. Lavorare con un modello diverso di topi del morbo di Huntington (R6/1) trovato modifiche EPPs che sembravano essere legati a proteine SNARE8. Per valutare i meccanismi che causano la trasmissione neuromuscolare alterata, sarebbe utile eliminare gli effetti di proprietà della membrana muscolare alterata tramite un morsetto di tensione. In uno studio recente, la trasmissione neuromuscolare R6/2 è stata studiata sotto entrambe le condizioni di corrente e tensione morsetto utilizzando la tecnica descritta nel presente documento. La totalità delle piastre laterali motore erano tensione-premuta con meno di 1% errore inserendo due microelettrodi all'interno la costante di lunghezza della placca motrice16. E ' stato quel morsetto di tensione corretti record corrente-morsetto ha reso a contrasto misurazioni della trasmissione neuromuscolare nel muscolo R6/2. Ciò evidenzia che può essere difficile da correggere EPPs per non-linearità, se sono state modificate le proprietà della membrana muscolare e Mostra i benefici di ottenere record di tensione-morsetto che sono indipendente dalle proprietà della membrana muscolare. Il protocollo presentato qui è ideale per l'esame di condizioni o patologie che influiscono sulla trasmissione sinaptica e le proprietà della membrana postsinaptica.

<table><tbody><tr><td>Microscopio composto Olympus</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>10x Obiettivo</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40x Obiettivo</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>Vetro borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Camera Santa Barbara Instruments Gruppo</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9 Pulse Generatore</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iso-flex Stimolo Isolatore</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Software di acquisizione e analisi dati</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo bipolare concentrico</td><td>FHC</td><td>CBDSH75</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore con giunto sferico</td><td>Narishige&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringhe non metalliche 34 Gauge</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon SMZ800N</td><td></td><td></td></tr><tr><td>n. 5 Pinze</td><td>Strumenti per la scienza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fine Forbici a molla</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>N. 2 Pinze</td><td>Roboz</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>Microdissezione Forbici</td><td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit elastomero siliconico</td><td>Dow Corning</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass SD9 Stimolatore</td><td>Grass Medical</td> Modello medico <td></td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Axon Digidata 1550 Sistema di acquisizione dati a basso rumore</td><td>Molecular Devices Filtro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>passa-basso Bessell</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore mancino</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore destrorso</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>Singolo Motion Controler</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore a rulli incrociati</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>Questo è stato aggiunto all'asse Z dei micromanipolatori sinistro e destro per consentire la motorizzazione dell'asse z. Questa configurazione personalizzata è più economica e meno ingombrante rispetto all'acquisto di un micromanipolatore motorizzato a 4 assi. Ci consente inoltre di controllare entrambi i micromanipolatori con un unico controller</td></tr><tr><td>Tutti i prodotti chimici sono stati ordinati da Fisher, ad eccezione</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>di BTS</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B315190</td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-Asp</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>Le sonde molecolari non sono più un'azienda. Ora ordinato tramite Fisher</td></tr></tbody></table>

levator auris longus preparazione per l'esame della trasmissione neuromuscolare dei mammiferi sotto condizioni di morsetto di tensione

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Questo protocollo descrive una tecnica di trasmissione sinaptica record dalla giunzione neuromuscolare in condizioni di corrente- e tensione-morsa. Una preparazione ex vivo di levator auris longus (LAL) è usata perché è un muscolo sottile che fornisce una visualizzazione semplice della giunzione neuromuscolare per impalamento microelettrodo presso il terminale del motoneurone. Questo metodo consente la registrazione dei potenziali spontanei miniatura della piastra laterale e correnti (mEPPs e mEPCs), i potenziali evocati del nervo della piastra laterale e correnti (EPPs ed EPCs), come pure le proprietà della membrana dei motoneurone. Risultati ottenuti da questo metodo includono il contenuto quantal (QC), numero di siti di rilascio delle vescicole (n), probabilità di rilascio delle vescicole (prel), facilitazione sinaptica e depressione, nonché la costante di tempo della membrana muscolare (τ m) e la resistenza di ingresso. Applicazione di questa tecnica di modelli murini di malattia umana può evidenziare patologie chiave negli Stati di malattia e aiutare a identificare nuove strategie terapeutiche. Dal completamente tensione-serraggio di una singola sinapsi, questo metodo fornisce una delle analisi più dettagliate della trasmissione sinaptica attualmente disponibili.

Figura 8 Mostra un esempio di impulsi di corrente (Figura 8A) e le risposte di tensione (Figura 8B) da una fibra di LAL sotto corrente-pinza da un 12-week-old wild type R6/2 del mouse. La presenza di mEPPs indica che questi record sono state prese dal terminale del motoneurone. I record sono stati ottenuti in soluzione fisiologica normale. Questi record corrente-morsetto possono essere analizzati per...

Il protocollo descritto in questo documento utilizza il muscolo di longus di levator auris (LAL) del mouse per registrare spontanea e nervo-evocata potenziali postsinaptici (corrente-clamp) e correnti (tensione-clamp) alla giunzione neuromuscolare. Utilizzo di questa tecnica può fornire spunti chiave nei meccanismi della trasmissione sinaptica in condizioni normali e malattia.

Levator Auris Longus Preparazione per l'esame della trasmissione neuromuscolare dei mammiferi sotto condizioni di morsetto di tensione

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare il muscolo elevatore lungo e il suo nervo al fine di registrare le correnti sinaptiche alla giunzione muscolare neurale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella fisiologia sinaptica come la dimensione della corrente della placca terminale, il contenuto quantico, la probabilità di rilascio e le relazioni tra neurotrasmissione ed eccitabilità muscolare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le registrazioni elettrofisiologiche dettagliate da una singola sinapsi possono essere facilmente combinate con esperimenti ottici su cellule vive.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione sinaptica e sulla comunicazione di feedback tra nervo e muscolo, può essere applicato anche ad altri sistemi che vanno dalla drosofila ai mammiferi. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la preparazione muscolare del nervo dei mammiferi è fragile, in particolare il nervo. Anche l'acquisizione e l'interpretazione accurata dei successivi dati di clamp di tensione possono essere impegnativi.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se ese

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Una valutazione funzionale della giunzione neuromuscolare (NMJ) può fornire informazioni essenziali sulla comunicazione tra nervo e del muscolo. Qui descriviamo un protocollo per valutare globalmente la giunzione neuromuscolare e il muscolo funzionalità utilizzando due preparazioni diverse del nervo-muscolo, cioè Soleo-sciatic e diaframma-frenico.

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Qui, presentiamo un protocollo che combina l'elettroporazione e la denervazione in vivo del muscolo elevatore cranico auris longus (LAL). Questa procedura consente lo studio del potenziale ruolo delle proteine di derivazione muscolare nella rigenerazione della sinapsi neuromuscolare.

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L'elettrofisiologia dinamica del clamp può stabilire collegamenti causali tra i deficit di attivazione neuronale e la disfunzione dei canali ionici. Descriviamo i metodi e i protocolli di clamp dinamico nei neuroni cerebellari di Purkinje di topo, rilevando risorse utili e considerazioni tecniche. In uno studio rappresentativo, abbiamo aggiunto la conduttanza del sodio modellata ai neuroni Tsc1-/- di Purkinje per evitare l'attivazione ripetitiva.

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Impara a isolare il muscolo levator auris longus del topo per registrare correnti sinaptiche alla giunzione neuromuscolare. Questo metodo elettrofisiologico consente di studiare la trasmissione sinaptica in condizioni normali e patologiche.

Levator Auris Longus Preparazione per lesame della trasmissione neuromuscolare dei mammiferi sotto condizioni di morsetto di tensione (Video) | JoVE Journal

Levator Auris Longus Preparazione per l'esame della trasmissione neuromuscolare dei mammiferi sotto condizioni di morsetto di tensione

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