Levator Auris Longus Preparazione per l'esame della trasmissione neuromuscolare dei mammiferi sotto condizioni di morsetto di tensione

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare il muscolo elevatore lungo e il suo nervo al fine di registrare le correnti sinaptiche alla giunzione muscolare neurale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella fisiologia sinaptica come la dimensione della corrente della placca terminale, il contenuto quantico, la probabilità di rilascio e le relazioni tra neurotrasmissione ed eccitabilità muscolare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le registrazioni elettrofisiologiche dettagliate da una singola sinapsi possono essere facilmente combinate con esperimenti ottici su cellule vive.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione sinaptica e sulla comunicazione di feedback tra nervo e muscolo, può essere applicato anche ad altri sistemi che vanno dalla drosofila ai mammiferi. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la preparazione muscolare del nervo dei mammiferi è fragile, in particolare il nervo. Anche l'acquisizione e l'interpretazione accurata dei successivi dati di clamp di tensione possono essere impegnativi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se eseguita correttamente. A dimostrare la procedura sarà Steve Burke del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, sotto un microscopio stereodissecante, praticare una piccola incisione nella pelle sul dorso del topo a livello delle scapole.

Usa un paio di forbici per microdissezione. Tagliare la pelle sopra la testa e la schiena. Quindi, tirare verso l'alto la pelle lungo l'incisione vicino alle scapole.

Taglia i muscoli che sono inferiori al LAL iniziando dalla scapola destra. Quindi, sollevare delicatamente il tessuto tagliato immediatamente a destra della linea mediana. Fai un taglio verso l'orecchio sinistro con le lame delle forbici premute contro il cranio per rimuovere diversi strati di muscolo che sono inferiori al PAL sinistro.

Evitare di tagliare il nervo che innerva il LAL che avvolge il condotto uditivo ed entra nei muscoli sul lato mediale dell'orecchio. Continua a tagliare il condotto uditivo mantenendo il più possibile il nervo attaccato. Quindi, tagliare il tessuto adiposo dietro il condotto uditivo lungo la parte ventrolaterale dell'orecchio.

Taglia lungo la scapola sinistra in modo simile alle procedure eseguite sul lato destro per rimuovere completamente il muscolo dal topo. Quindi, taglia il padiglione auricolare dell'orecchio lungo la base lasciando la parte cartilaginea dell'orecchio attaccata al LAL. Capovolgi il muscolo in modo che il lato inferiore sia rivolto verso l'alto.

Per isolare il muscolo LAL, posizionare il LAL e il tessuto circostante in una piastra di Petri con un fondo in elastomero di silicio e fissare il tessuto sezionato sul fondo. Lavare frequentemente il fazzoletto in una soluzione fisiologica. Quindi, posiziona uno spillo per insetti attraverso il condotto uditivo per tenere la preparazione in posizione.

Usando spilli più piccoli, appunta il tessuto rimanente sul lato opposto della linea mediana del LAL. Usa un paio di pinze. Tirare delicatamente la pelle verso l'alto sulla parte laterale dell'orecchio per allungare il muscolo e posizionare un piccolo spillo attraverso la pelle.

Ripetere questo passaggio fino a quando il fazzoletto non è ben fissato al piatto. Rimuovere i muscoli che coprono il LAL e quelli legati al LAL tramite il tessuto connettivo e sono particolarmente tesi vicino alla linea mediana. Successivamente, sollevare lo strato muscolare sovrastante e tagliare il tessuto connettivo con le lame orientate verso lo strato muscolare da tirare.

Taglia verso la linea mediana fino a circa 3/4 della linea mediana e continua a rimuovere gli strati muscolari fino a quando rimane solo il LAL. Durante il processo di pulizia, assicurarsi che i nervi non siano danneggiati. Successivamente, rimuovere parte del tessuto connettivo rimanente che copre il LAL per favorire l'impalamento degli elettrodi.

Rimuove solo il tessuto che può essere fatto facilmente senza il rischio di danneggiare il LAL nel processo. Per identificare il nervo che innerva la LAL, utilizzando uno stimolatore nervoso, toccare i nervi con lo stimolatore nervoso. Quando il muscolo si contrae, è stato identificato il nervo corretto.

Quindi, afferra con cura il tessuto vicino al nervo e usa le forbici a molla per separare il nervo dal tessuto che circonda l'orecchio. Per ridurre al minimo i danni, mantenere la maggior parte del nervo incorporato in un tessuto circostante che verrà utilizzato in seguito per fissare il nervo al disco di registrazione. A questo punto, lo sperimentatore può fare una pausa di un'ora, purché il LAL sia immerso in 20 millilitri o più di una soluzione salina fisiologica.

Successivamente, sganciare e trasferire il muscolo su un tavolino sotto il microscopio di dissezione per esperimenti di elettrofisiologia. Appunta il muscolo alle estremità e lungo il suo bordo. Posiziona il nervo perpendicolarmente alle fibre muscolari e fissalo sul fondo del piatto attraverso del tessuto in eccesso che è stato lasciato intatto alla fine del nervo.

Mantenere sempre il tessuto immerso in una soluzione salina fisiologica. Per gli esperimenti di elettrofisiologia, fissare la camera di perfusione con il LAL al tavolino del microscopio. Posizionare l'elettrodo di riferimento in una tazza riempita con cloruro di potassio a tre molari che è collegata alla camera di registrazione tramite un ponte agar.

A questo punto, posizionare l'elettrodo stimolante il nervo sul nervo. Esporre la preparazione LAL a 4-Di-2-Asp per 10 minuti per ottenere una florescenza adeguata per la visualizzazione della giunzione neuromuscolare. Dopo 10 minuti, scambiare la soluzione di 4-Di-2-Asp con la normale soluzione di calcio.

Nel frattempo, riempire i capillari di vetro con le soluzioni appropriate per gli elettrodi di rilevamento della tensione e di passaggio della corrente. Picchiettare delicatamente il capillare per rimuovere eventuali bolle d'aria e fissare il capillare riempito nel portaelettrodo sull'headstage. Utilizzando un microscopio verticale con illuminazione standard a campo chiaro e a florescenza, cerca una banda luminosa di giunzioni neuromuscolari verdi fluorescenti che corrono perpendicolarmente alle fibre muscolari lungo la preparazione con un obiettivo a immersione in acqua a basso ingrandimento.

Quindi, passare a un obiettivo di immersione in acqua a più alto ingrandimento per identificare una giunzione neuromuscolare sullo strato superiore del muscolo al fine di esaminarla con l'elettrofisiologia. Utilizzando principalmente il campo chiaro, posizionare l'elettrodo sopra la membrana muscolare entro 100 micron dalla giunzione neuromuscolare identificata. Questa figura mostra un esempio degli impulsi di corrente e delle risposte di tensione da una fibra LAL sotto pinza amperometrica da un topo R62 wild-type di 12 settimane.

I record sono stati ottenuti in soluzione salina fisiologica normale e la presenza di mEPP indica che questi record sono stati prelevati dalla piastra terminale del motore. Ecco una registrazione rappresentativa di un EPC e due mEPC ottenuti in condizioni di morsetto di tensione. Questa figura mostra le EPC e le mEPC sovrapposte da una fibra rappresentativa.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se eseguita correttamente. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging di cellule vive con coloranti di membrana come FM143 o l'istologia per rispondere a domande relative all'assorbimento del rilascio di vescicole o ai cambiamenti morfologici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia per esplorare la trasmissione sinaptica e la comunicazione tra cellule nervose in organismi che vanno dalla drosofila ai mammiferi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare il muscolo elevatore lungo innervato per registrare le correnti sinaptiche alla giunzione neuromuscolare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prestare molta attenzione nella rimozione del tessuto muscolare adiacente al LAL e nell'isolamento del nervo.