Raccolta le tossine veleno da Assassin Bugs e altri insetti Heteropteran

Anche se molti insetti in sottordine Heteroptera (Insecta: Hemiptera) sono velenoso, loro composizione del veleno e le funzioni delle loro tossine del veleno sono per lo più sconosciute. Questo protocollo descrive i metodi per la raccolta heteropteran veleni per ulteriore caratterizzazione, mediante elettrostimolazione, molestie e dissezione della ghiandola.

Gli insetti assassini sono un gruppo di insetti che usano il veleno per paralizzare e pre-digerire le loro prede. Tuttavia, nonostante i veleni animali siano interessanti come nuovi medicinali, insetticidi e strumenti scientifici, le tossine che producono sono quasi del tutto non caratterizzate. Uno dei motivi è che gli insetti assassini sono meno conosciuti rispetto agli iconici artropodi velenosi come ragni e scorpioni.

Un altro motivo è che fino a poco tempo fa erano disponibili poche informazioni su come raccogliere le tossine. In questo video, presenteremo metodi che consentiranno ai ricercatori di raccogliere con successo le tossine del veleno dagli insetti assassini e anche dagli insetti correlati come gli insetti acquatici giganti che uccidono i pesci. Il primo protocollo descrive come raccogliere il veleno mediante elettrostimolazione.

Innanzitutto, raccogli gli insetti adatti. Gli adulti e le grandi ninfe sono i più facili con cui lavorare. L'uso di insetti da due a sette giorni dopo l'alimentazione è l'ideale, per garantire che gli insetti abbiano accumulato scorte di veleno ma non muoiano di fame.

Preparare un paio di pinze con elettrodi sulle punte e collegarle a una presa di corrente. Idealmente, questa alimentazione dovrebbe essere un elettrostimolatore in grado di erogare impulsi di cinque millisecondi a cinque Hertz. Utilizzare tensioni di picco comprese tra 15 e 25 volt rispettivamente per microspie piccole o grandi.

Se non è disponibile un elettrostimolatore, utilizzare tensioni costanti da cinque a 12 volt. Trattiene l'insetto usando elastici e una piattaforma di schiuma. Posizionare la proboscide dell'insetto in un tubo di raccolta.

Una pipetta P200 è ideale per la maggior parte degli insetti assassini. Opzionalmente, è possibile aggiungere una piccola quantità di acqua alla punta prima della raccolta, per garantire il massimo recupero del veleno. Applicare il gel conduttivo sugli elettrodi, accendere l'alimentatore e applicare le pinzette elettrificate sull'insetto.

Sperimenta una serie di punti di contatto mentre monitori l'espulsione del veleno dalla proboscide. Conservare il veleno a temperature di congelamento per evitare la digestione autoproteolitica. Ripetere l'elettrostimolazione con un nuovo tubo per pipette fino a quando non è più

Il secondo protocollo descrive come raccogliere il veleno provocando una reazione difensiva. Preparare e trattenere un insetto come descritto sopra, inserendo la proboscide in una punta di raccolta. Molesta delicatamente l'insetto per provocare una reazione difensiva, senza ferire l'animale.

A volte, il semplice trattenimento dell'animale o l'inserimento della proboscide nella provetta di raccolta può provocare una reazione difensiva accompagnata dall'espulsione del veleno dalla proboscide. In caso contrario, tocca delicatamente l'animale sul torace, sulle zampe, sull'addome e soprattutto sulle antenne, per provocare il veleno. Nel terzo protocollo, nella forma scritta di questo articolo, descriviamo anche come raccogliere il veleno dalle specie che sputano veleno in modo difensivo.

Il protocollo quattro descrive come raccogliere il veleno direttamente dalle ghiandole velenifere mediante dissezione. Anestetizzare gli animali mediante esposizione all'anidride carbonica per 10 minuti. Inserisci tre perni nell'addome posteriore per tenere fermo l'insetto senza perforare le ghiandole velenifere.

Praticare una breve incisione sulla linea mediana nella superficie ventrale dell'addome utilizzando un bisturi in miniatura. Usa le forbici in miniatura per estendere la linea mediana in direzione anteriore alla testa, avendo cura di tagliare solo l'esoscheletro e di non danneggiare le strutture interne. Per esporre le strutture interne, eseguire più tagli laterali che si estendono dall'incisione della linea mediana al lato dell'insetto.

L'esoscheletro ventrale tra ogni due tagli può quindi essere appuntato all'indietro per rivelare le strutture interne. Inondare il vassoio di dissezione utilizzando una soluzione salina fino a quando l'insetto non è sommerso, consentendo alle strutture interne di galleggiare e di essere visualizzate più facilmente. Le ghiandole velenifere appariranno come strutture allungate traslucide che si estendono su ciascun lato del canale alimentare.

Utilizzando pinzette e microforbici, rimuovere con cura il tessuto connettivo e nervoso e la trachea, cercando di non rompere il canale alimentare o le ghiandole velenifere. La ghiandola principale è riconoscibile per la sua struttura caratteristica, con lobi anteriori e posteriori e due dotti che si incontrano all'ilo. Per gli insetti assassini, e forse per altri eterotteri, quasi tutte le tossine sono immagazzinate nei lumi dei due lobi della ghiandola principale.

Pertanto, dopo aver liberato la ghiandola principale dalla trachea e dal tessuto connettivo, i due dotti che partono dall'ilo possono essere tagliati e la ghiandola velenifera principale può essere raccolta. Se si desidera anche la ghiandola accessoria, di solito è strettamente opposta all'intestino e può essere identificata in modo inequivocabile tracciando i dotti dall'ilo. In ogni caso, fare attenzione a non rompere prematuramente le ghiandole e a non perdere il veleno nella soluzione salina circostante.

Se i lobi della ghiandola principale devono essere separati, farlo rapidamente dopo la rimozione dalla soluzione salina e procedere immediatamente alla raccolta del contenuto dei lumi della ghiandola, come descritto nei passaggi 4.6 e 4.7 del manoscritto. I risultati variano a seconda dell'esatto sottoprotocollo e della specie di insetto utilizzata. Il primo e il secondo sottoprotocollo presentati in questo video hanno mostrato come raccogliere le tossine del veleno rispettivamente mediante elettrostimolazione e molestie.

Entrambi questi metodi producono in genere un liquido concentrato contenente circa 50-250 milligrammi per mil di proteine e oltre 100 componenti a base di proteine, tra cui enzimi, tossine che formano i pori e peptidi. Il vantaggio principale di entrambi questi protocolli è che sono rapidi, non letali e il veleno non è contaminato dal tessuto ghiandolare. Il più grande svantaggio per la raccolta mediante elettrostimolazione o molestie è che la fonte ghiandolare del veleno ottenuto è sconosciuta e il contenuto proteico del veleno raccolto può differire, a seconda del protocollo.

Inoltre, l'elettrostimolazione e le molestie non sono efficaci per tutte le specie predatrici di eterotteri. Nell'ultimo sottoprotocollo, abbiamo mostrato come sezionare le ghiandole velenifere gonfie per raccogliere direttamente le tossine. Questa tecnica produce anche un cocktail di proteine diverse, anche se in questo caso le tossine del veleno possono mostrare una certa contaminazione con il tessuto ghiandolare.

Tuttavia, un vantaggio della raccolta delle tossine dalle ghiandole sezionate è che il compartimento ghiandolare di origine è noto esattamente. In conclusione, incoraggiamo i ricercatori a selezionare un metodo di raccolta appropriato alla loro domanda di ricerca. Ad esempio, le indagini sulla biologia dell'uso del veleno all'interno di una specie trarranno vantaggio dall'impiego di più tecniche di raccolta.

Per gli studi di bioprospezione, un unico metodo per la raccolta di veleni da più specie può essere più economico, a seconda dello specifico disegno sperimentale. Speriamo che questo video e l'articolo scritto che lo accompagna facilitino i ricercatori a raccogliere il veleno da insetti assassini e altri insetti eterotteri, che è un prerequisito per comprenderne la composizione, la bioattività e l'evoluzione.