Name: Raccolta le tossine veleno da Assassin Bugs e altri insetti Heteropteran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri i metodi per raccogliere il veleno da Reduviidae e altri insetti eterotteri usando elettrostimolazione e dissezione ghiandolare. Queste tecniche facilitano la caratterizzazione delle tossine per applicazioni mediche.

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Riconosciamo finanziari di sostegno dall'Australian Research Council (sovvenzioni DP130103813 e LP140100832 a G.F.K., DECRA Fellowship DE160101142 a ELHAJEB), l'Australian National Health & Medical Research Council (Principal Research Fellowship APP1044414 a G.F.K.) e la University of Queensland (Postdoctoral Fellowship a A.A.W.).

Questo protocollo conforme alle politiche di The University of Queensland enunciati in Responsible Care e utilizzare degli animali nell'insegnamento e nella ricerca (PPL 4.20.11) così come il National Health e Medical Research Council codice australiano per la cura e uso di animali per fini scientifici (8th edizione 2013).
Attenzione: fare attenzione a non per essere envenomated quando si gestisce assassin bug. Fare attenzione a proteggere gli occhi quando si maneggia la specie che sputare veleno sulla difensiva. Prendersi cura in tutto di non ferire gli animali sperimentali. Questo include il monitoraggio della pressione sulle restrizioni come elastici e garantendo che la proboscide non è rotta.
Nota: Facoltativamente, anestetizzare gli animali tramite l'esposizione al CO2 per 0,5-2 min o raffreddamento a 4-10 ° C prima della raccolta di veleno mira 1-3 per facilitare il trasferimento sicuro e fermo. Anestetizzazione non è strettamente necessaria, ma può facilitare sicuro contenimento degli esemplari agili o forti. Tuttavia, gli animali devono essere svegli per consentire la raccolta di veleno. Mantenere le applicazioni a valle in mente quando si decide o meno di aggiungere gli inibitori della proteasi.
1. tossine veleno da elettrostimolazione di raccolta
<ol><li>Ottenere esemplari vivi da cui raccogliere le tossine.</li>
	<li>Pinzette di plastica pre-preparate di uso con elettrodi positivi e negativi montato su qualsiasi suggerimento. Connettersi elettrificate pinzette un elettrostimolatore o una fonte di tensione costante che permette la regolazione della tensione.<ol>
<li>Per le piccole (~ 10 mm) e grandi (circa 25 mm) assassin bug, utilizzare tensioni di picco di 15 e 25 V rispettivamente.</li>
		<li>Per heteropterans più grandi come insetti giganti di acqua, utilizzare fino a 40 V.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trattenere gli insetti vivi di reggiatura li a una piattaforma, utilizzando un nastro di gomma sopra il torace.</li>
	<li>Posizionare la punta della proboscide in una punta di raccolta adatta. Per assassin bug, usare una punta di pipetta P200. Per insetti giganti di acqua, tagliare l'estremità fuori una punta di P200 per aumentare la dimensione dell'apertura.<ol>
<li>Sollevare la proboscide con un paio di pinzette pulite chiusi delicatamente e spingere il diaframma aperto della collezione punta sopra l'estremità della proboscide.</li>
		<li>Se lo si desidera, prima di mettere la proboscide nella raccolta dell'acqua ultrapura assorbimento ~ 5 µ l suggerimento. Questo riduce le perdite di veleno rimanendo all'interno della punta, anche se il veleno raccolto sarà diluito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Applicare l'elettrostimolazione. Immergere gli elettrodi stimolanti in gel conduttivo, come glicerolo NaCl/50% 2,5 M. Applicare gli elettrodi al torace. Per belostomatids, applicare i due elettrodi di superficie dorsale posteriore della testa.</li>
	<li>Memorizzare il veleno per evitare autodegradation. Dopo veleno viene estruso, rapidamente di trasferirla a un tubo a-20 ° C o da-60 ° C, o un tubo contenente cocktail inibitore della proteasi.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.5 e 1.6 è acquisito sufficiente veleno o nessun ulteriore veleno è imminente.</li>
</ol>2. raccolta delle tossine veleno da molestie
<ol><li>Preparare gli animali per la raccolta del veleno e posizionare la punta della proboscide in un vestibolo di collezione, come descritto nei paragrafi 1.1 e 1.3-1.4.</li>
	<li>Se il veleno viene estruso spontaneamente, passare al punto 2.3. In caso contrario, molestare gli animali toccandola delicatamente sulle gambe, addome e antenne con pinzette fino a quando il veleno è prodotto.</li>
	<li>Trasferire rapidamente il veleno in una provetta a-20 ° C o da-60 ° C o un inibitore della proteasi che contengono tubo cocktail, se lo si desidera.</li>
</ol>3. raccolta delle tossine veleno da molestie da Venom "Sputare" specie
<ol><li>Anestetizzare, o anestetizzare parzialmente, l'insetto prima di rimuoverla dal suo alloggiamento per prevenire qualsiasi prematuro sputare sulla difensiva.</li>
	<li>Provocare il comportamento di sputare veleno. Contenere e riposizionare l'insetto con il coperchio profondo della standard 90 x 16mm di Petri. Tenere il coperchio leggermente posteriore e 1-4 cm sopra l'insetto per impedire il volo. Maggior parte degli insetti sputerà spesso parecchie volte, in rapida successione. Garantire che tutti i venom sono raccolti sul lato inferiore del piatto.</li>
	<li>Raccogliere il veleno sulla parte inferiore del piatto Petri risciacquando con 10 µ l di acqua ultrapura. Rapidamente di trasferirlo in un tubo a-20 ° C o da-60 ° C, o un tubo contenente cocktail inibitore della proteasi.</li>
</ol>4. raccolta Venom tossine tramite la dissezione della ghiandola
<ol><li>Sacrificare gli animali. Pesantemente anestetizzare o uccidere animali utilizzando > 5min esposizione al CO2. Tubo puro CO2 direttamente in aria-fori della recinzione di alloggiamento dell'animale.</li>
	<li>Insetto di pin al vassoio di dissezione. Per assassin bug, dissecare attraverso la superficie ventrale (4.3). Per insetti giganti di acqua, dissecare attraverso la superficie dorsale (4.4).</li>
	<li>Dissezione ventrale<ol>
<li>Inserire tre perni nell'addome posteriore per mantenere l'insetto senza perforare le ghiandole velenifere.</li>
		<li>Tagliare un'incisione del midline breve nella superficie ventrale dell'addome usando un bisturi in miniatura. Usare le forbici in miniatura per estendere l'incisione del midline anteriormente alla testa, avendo cura di tagliare l'esoscheletro solo e non danneggiare strutture interne.</li>
		<li>Per esporre le strutture interne, rendono più tagli laterali che si estende dall'incisione del midline al lato dell'insetto. Quindi, pin indietro ogni lembo di esoscheletro ventrale per rivelare strutture interne.</li>
		<li>Per grande assassino insetti, fare quattro incisioni laterali, in metà di-addome, anteriore addome, tra le gambe di prime e seconda e di fronte la prima tappa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissezione dorsale<ol>
<li>Rimuovere le ali vicino alla base. Inserire tre perni nell'addome posteriore per mantenere l'insetto senza perforare le ghiandole velenifere.</li>
		<li>Tagliare un'incisione mediana dalla testa all'addome con delle miniatura forbici, bisturi, avendo cura di tagliare l'esoscheletro solo e non danneggiare strutture interne.</li>
		<li>Forza a parte le due metà dell'insetto. Posto diversi pin lateralmente lungo la lunghezza dell'insetto per lasciare la cavità interna esposta.</li>
		<li>Rimuovere i muscoli di volo con una pinzetta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inondare il vassoio di dissezione. Aggiungere PBS fino a quando il bug è sommerso per consentire strutture interne galleggiano ed essere più facilmente visualizzati.</li>
	<li>Micro-forbici e pinzette, rimuovere delicatamente con connettivo e tessuto nervoso e della trachea. Le ghiandole velenifere appaiono come allungata, costruzioni trasparenti che si estendono lungo ciascun lato del canale alimentare.<ol>
<li>Identificare la ghiandola principale per il suo aspetto caratteristico, con lobi anteriori e posteriori e due condotti incontro al hilus.</li>
		<li>Se lo si desidera, è possibile identificare la ghiandola accessoria tracciando il condotto da hilus. Gratis la ghiandola principale tagliando i due condotti che emana dal hilus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere i lumen della ghiandola desiderata. Trasferire la ghiandola in una microcentrifuga sul ghiaccio contenente 30 µ l di PBS o PBS più inibitore di proteasi cocktail. Lancia le ghiandole con un pin pulito tagliente.<ol>
<li>Vortexare per 10 s e centrifugare (1 min, 5.000 × g, 4 ° C) per svuotare i lumen della ghiandola. Rimuovere il tessuto ghiandolare con una pinzetta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chiarire l'Estratto di tossina. Centrifugare (5 min, 17.000 × g, 4° C) per rimuovere eventuali particelle solide, conservando il supernatante e scartando il pellet. Conservare a-20 ° C o da-60 ° C per evitare la degradazione di autoproteolytic.</li>
</ol>

<ol><li>Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venoms+of+heteropteran+insects%3A+A+treasure+trove+of+diverse+pharmacological+toolkits%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits.</a> Toxins. 8 (2), 43(2016).</li>
<li>Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/journals/psyche/2012/470436/">An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera.</a> Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).</li>
<li>Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/320234828_Quantification_protein_content_and_paralytic_potential_of_saliva_of_fed_and_prey_deprived_reduviid_Acanthaspis_pedestris_Stal_Heteroptera_Reduviidae_Reduviinae">Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae).</a> Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).</li>
<li>Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://jeb.biologists.org/content/38/1/61">The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae).</a> Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).</li>
<li>Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZerachia%2C+T+%22Animal+and+Plant+Toxins%22">Animal and Plant Toxins</a>. Kaiser, E. , Goldman. 143-146 (1973).</li>
<li>Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fish-killing+water+bug+reveals+ancient+and+dynamic+venom+evolution+in+Heteroptera%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li>
<li>Walker, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fish-killing+water+bug+reveals+ancient+and+dynamic+venom+evolution+in+Heteroptera%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera.</a> Cell. Mol. Life Sci. , (2018).</li>
<li>Walker, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assassin+bug+Pristhesancus+plagipennis+produces+two+distinct+venoms+in+separate+gland+lumens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens.</a> Nature Communications. 9 (1), 755(2018).</li>
<li>Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+triabin+protein+family+of+American+hematophagous+reduviids%3A+Functional%2C+structural+and+phylogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis.</a> Toxins. 8 (2), 44(2016).</li>
<li>Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+the+saliva+of+Triatoma+infestans+%28Heteroptera%3A+Reduviidae%29+on+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels.</a> Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).</li>
<li>Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+peptides+from+assassin+bugs+%28Hemiptera%3A+Reduviidae%29%3A+isolation%2C+chemical+and+biological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization.</a> FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).</li>
<li>Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+milking+and+electric+shocks+for+venom+collection+from+hunter+reduviids%5BTitle%5D)+AND+%22Entomon%22%5BJournal%5D)">Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids.</a> Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).</li>
<li>Silva-Cardoso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+activity+of+lysophosphatidylcholine+from+saliva+of+the+waterbug+Belostoma+anurum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum.</a> Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).</li>
<li>Noeske-Jungblut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triabin%2C+a+highly+potent+exosite+inhibitor+of+Thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).</li>
<li>Noeske-Jungblut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+collagen-induced+platelet+aggregation+from+the+saliva+of+Triatoma+pallidipennis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).</li>
<li>Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. <a target="_blank" href="http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1678-91992006000300011">Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens.</a> Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).</li>
<li>Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201301326115">Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae).</a> Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).</li>
<li>Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaran%2C+SPM+%22Biotechnological+Applications+for+Integrated+Pest+Management%22">Biotechnological Applications for Integrated Pest Management</a>. , Oxford Publishing. 125-131 (2000).</li>
<li>Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaran%2C+SPM+%22Insect+Pest+Management%2C+A+Current+Scenario%22">Insect Pest Management, A Current Scenario</a>. Ambrose, D. P. , Entomology Research Unit. 346-361 (2011).</li>
<li>Pereira, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulant+activity+of+Triatoma+infestans+and+Panstrongylus+megistus+saliva+%28Hemiptera%2FTriatominae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae).</a> Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+salivary+vasodilator+in+the+blood-sucking+bug%2C+Rhodnius+prolixus%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus.</a> British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+prolixin-S+%28nitrophorin+2%29%2C+the+salivary+anticoagulant+of+the+blood-sucking+bug+Rhodnius+prolixus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Journal%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus.</a> Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).</li>
<li>Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+salivary+gland+and+salivary+enzymes+of+the+giant+waterbugs+%28Heteroptera%3B+Belostomatidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae).</a> Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).</li>
<li>Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1469-7998.1995.tb02743.x/full">On the 'spitting' behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae).</a> Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).</li>
<li>Fink, L. S. <a target="_blank" href="https://bugguide.net/node/view/1371711">Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae).</a> Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).</li>
<li>Herzig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogenesis%2C+gender%2C+molting+influence+the+venom+yield+in+the+spider+Coremiocnemis+tropix+%28Araneae%2C+Theraphosidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Venomous+Research%22%5BJournal%5D)">Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae).</a> Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).</li>
<li>Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+electrophoretic+analyses+of+saliva+from+the+predatory+reduviid+species+Rhynocoris+marginatus+%28Fab%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab).</a> Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La fase più critica nella raccolta del veleno assassin bug sta selezionando il metodo appropriato a seconda della finalità dello studio. Ognuno dei tre metodi presentati per la raccolta heteropteran veleni ha vantaggi e svantaggi a seconda delle applicazioni a valle.
Inducendo il bug di espellere il veleno da proboscide (protocolli 1-3) evita la contaminazione del veleno dai tessuti ghiandolari. Inoltre, questi metodi sono non-letale e possono essere ripetuti più volte nel corso della vita di ...

Heteropteran veleni sono sostanze bioattive potentemente1. Ad esempio, le secrezioni di veleno/saliva di sangue-alimentazione Heteroptera come kissing bugs (eziologico) e cimici (Cimicidae) facilita l'alimentazione interrompendo l'emostasi2. Tossine in questi veleni bersaglio vie multiple compreso coagulazione, aggregazione piastrinica e vasocostrizione, come pure il dolore e prurito vie. Veleni dalla maggior parte delle altre specie di heteropteran sono adattati per facilitare la predazione, piuttosto che sangue-alimentazione. Loro veleni causano paralisi, morte e liquefazione del tessuto quando iniettato in invertebrati3,4. Quando iniettato in vertebrati, il loro veleno può anche avere effetti drastici. Ad esempio, l'iniezione di veleno dal assassin bug Holotrichius interno nei vertebrati provoca dolore, paralisi del muscolo e l'emorragia; topi envenomated da questo bug muoiono rapidamente a causa di paralisi respiratoria5.
Trascrittomica e proteomica hanno rivelato la composizione proteica di alcuni veleni di heteropteran. Veleni di specie selvatiche sono ricchi di proteasi, altri enzimi e peptidi e proteine di struttura sconosciuta e funzione6,7,8. Bug baciare veleno è ricca di famiglia delle proteine triabin, i cui membri influenzano profondamente la coagulazione, l'aggregazione piastrinica e vasocostrizione2,9. Tuttavia, non è noto quali tossine sono alla base della maggior parte bioattività di veleno. Ad esempio, il veleno del bug baciare Triatoma infestans è stata segnalata per essere analgesico ed inibire i canali di sodio10, ma i componenti responsabili restano delucidare. Allo stesso modo, non è noto quali componenti di assassin bug veleno causano paralisi o dolore. Un prerequisito per l'identificazione le tossine responsabili bioattività particolare veleno e per la caratterizzazione di struttura e funzione delle tossine veleno romanzo, è l'ottenimento di veleno.
Veleno è stata ottenuta da heteropterans da elettrostimolazione5,6,7,8,11,12,13, provocazione di difensivo le risposte4,8, meccanicamente comprimendo il torace12,14,15,16, dissezione veleno ghiandole8,17 ,18,19,20,21,22e applicazione di agonisti del recettore muscarinico23. A giudicare i potenziali vantaggi e gli svantaggi di ogni metodo è complicata dalla morfologia delle ghiandole velenifere heteropteran, che consistono di una ghiandola principale con due separati lumen, la ghiandola principale anteriore (AMG) e la ghiandola principale posteriore (PMG), nonché un associato ghiandola accessoria (AG). Questi scomparti di diverse ghiandole producono secrezioni proteiche diverse, che possono essere specializzate per le diverse funzioni biologiche tra cui la cattura di prede, difesa e digestione extra-orale8,17. In peiratine ed ectrichodiine assassin bug, la AMG è stata associata con la cattura di prede e il PMG con digestione extra-orale17. Tuttavia, nel harpactorine bug Pristhesancus plagipennis PMG è specializzata per la cattura di prede e digestione mentre la AMG è supposto a secernere veleno difensivo8. L'AG è stato descritto come avendo poco funzione secretiva in assassin bug8 o come un importante sito di stoccaggio di proteasi in insetti giganti acqua23. Chiaramente, ulteriore lavoro è necessario per chiarire la funzione di ciascun comparto di ghiandola tra vari sottogruppi di heteropteran e per determinare la funzione della maggior parte delle tossine del veleno. In questo rapporto descriviamo i protocolli per la raccolta le tossine veleno da heteropterans verso questo obiettivo.

<table><tbody><tr><td>Elettrostimolatore</td><td>Grass Technologies</td><td>Stimolatore a impulsi quadrati S48</td><td>Elettrostimolatore che consente l'elettrostimolazione pulsata</td></tr><tr><td>Pinzette leggere come una piuma</td><td>Forniture entomologiche australiane</td><td>E122B</td><td>Per la manipolazione di insetti velenosi vivi</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma</td><td>4693124001</td><td>Per prevenire la digestione autoproteolitica del veleno</td></tr><tr><td>Dissezione attrezzature</td><td>Forniture entomologiche australiane</td><td>E152Micro</td><td>Per dissezioni fini</td></tr><tr><td>Spille per insetti</td><td>Forniture entomologiche australiane</td><td>E162</td><td>Per dissezioni fini</td></tr></tbody></table>

raccolta le tossine veleno da assassin bugs e altri insetti heteropteran

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Heteropteran insetti ad esempio assassin bug (Reduviidae) e insetti giganti di acqua (Belostomatidae) discendono da un antenato comune selvatiche e velenoso, e la maggior parte dei heteropterans esistenti conserva questa strategia trofica. Alcuni heteropterans hanno effettuato la transizione a nutrire il sangue dei vertebrati (ad esempio i bug baciare, eziologico; e cimici, Cimicidae) mentre gli altri sono ritornati all'alimentazione sulle piante (la maggior parte Pentatomomorpha). Tuttavia, con l'eccezione della saliva utilizzata da kissing bugs per facilitare l'alimentazione di sangue, poco è conosciuta circa i veleni di heteropteran rispetto ai veleni di ragni, scorpioni e serpenti.
Un ostacolo alla caratterizzazione delle tossine del veleno di heteropteran è la struttura e la funzione delle ghiandole labiali/veleno, che sono entrambi morfologicamente complessa e svolgere più ruoli biologici (difesa, cattura di prede e digestione extra-orale). In questo articolo, descriviamo tre metodi che abbiamo usato con successo per raccogliere heteropteran veleni. In primo luogo, vi presentiamo l'elettrostimolazione come un modo pratico per raccogliere il veleno che è spesso letale quando iniettato in preda di animali, e che previene la contaminazione di tessuto ghiandolare. In secondo luogo, indichiamo che dolce molestie degli animali sono sufficiente a produrre estrusione di veleno dalla proboscide e/o veleno sputare in alcuni gruppi di heteropterans. In terzo luogo, descriviamo i metodi per raccogliere le tossine veleno tramite la dissezione di animali anestetizzati per ottenere le ghiandole velenifere. Questo metodo è complementare ad altri metodi, come può consentire la raccolta delle tossine da taxa in cui l'elettrostimolazione e molestie sono inefficaci. Questi protocolli permetterà ai ricercatori di raccogliere le tossine da insetti di heteropteran per la caratterizzazione di struttura-funzione e possibili applicazioni in medicina e agricoltura.

Alcune specie di heteropteran, come harpactorine p. plagipennis e il reduviine Platymeris rhadamanthus, resa in modo affidabile grandi quantità (5-20 µ l) di veleno in risposta all'elettrostimolazione (tabella 1). In generale, peiratine, reduviine e harpactorine maggior parte dei bug resa veleno in risposta a questo metodo. Tra stenopodaine bug, elettrostimolazione ha suscitato veleno da sp. Oncocephalus ma non Thodelmus sp. I bug di ho...

Anche se molti insetti in sottordine Heteroptera (Insecta: Hemiptera) sono velenoso, loro composizione del veleno e le funzioni delle loro tossine del veleno sono per lo più sconosciute. Questo protocollo descrive i metodi per la raccolta heteropteran veleni per ulteriore caratterizzazione, mediante elettrostimolazione, molestie e dissezione della ghiandola.

Raccolta le tossine veleno da Assassin Bugs e altri insetti Heteropteran

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Gli insetti assassini sono un gruppo di insetti che usano il veleno per paralizzare e pre-digerire le loro prede. Tuttavia, nonostante i veleni animali siano interessanti come nuovi medicinali, insetticidi e strumenti scientifici, le tossine che producono sono quasi del tutto non caratterizzate. Uno dei motivi è che gli insetti assassini sono meno conosciuti rispetto agli iconici artropodi velenosi come ragni e scorpioni.Un altro motivo è che fino a poco tempo fa erano disponibili poche informazioni su come raccogliere le tossine. In questo video, presenteremo metodi che consentiranno ai ricercatori di raccogliere con successo le tossine del veleno dagli insetti assassini e anche dagli insetti correlati come gli insetti acquatici giganti che uccidono i pesci. Il primo protocollo descrive come raccogliere il veleno mediante elettrostimolazione.Innanzitutto, raccogli gli insetti adatti. Gli adulti e le grandi ninfe sono i più facili con cui lavorare. L'uso di insetti da due a sette giorni dopo l'alimentazione è l'ideale, per garantire che gli insetti abbiano accumulato scorte di veleno ma non muoiano di fame.Preparare un paio di pinze con elettrodi sulle punte e collegarle a una presa di corrente. Idealmente, questa alimentazione dovrebbe essere un elettrostimolatore in grado di erogare impulsi di cinque millisecondi a cinque Hertz. Utilizzare tensioni di picco comprese tra 15 e 25 volt rispettivamente per microspie piccole o grandi.Se non è disponibile un elettrostimolatore, utilizzare tensioni costanti da cinque a 12 volt. Trattiene l'insetto usando elastici e una piattaforma di schiuma. Posizionare la proboscide dell'insetto in un tubo di raccolta.Una pipetta P200 è ideale per la maggior parte degli insetti assassini. Opzionalmente, è possibile aggiungere una piccola quantità di acqua alla punta prima della raccolta, per garantire il massimo recupero del veleno. Applicare il gel conduttivo sugli elettrodi, accendere l'alimentatore e applicare le pinzette elettrificate sull'insetto.Sperimenta una serie di punti di contatto mentre monitori l'espulsione del veleno dalla proboscide. Conservare il veleno a temperature di congelamento per evitare la digestione autoproteolitica. Ripetere l'elettrostimolazione con un nuovo tubo per pipette fino a quando non è più disponibile veleno.Il secondo protocollo descrive come raccogliere il veleno provocando una reazione difensiva. Preparare e trattenere un insetto come descritto sopra, inserendo la proboscide in una punta di raccolta. Molesta delicatamente l'insetto per provocare una reazione difensiva, senza ferire l'animale.A volte, il semplice trattenimento dell'animale o l'inserimento della proboscide nella provetta di raccolta può provocare una reazione difensiva accompagnata dall'espulsione del veleno dalla proboscide. In caso contrario, tocca delicatamente l'animale sul torace, sulle zampe, sull'addome e soprattutto sulle antenne, per provocare il veleno. Nel terzo protocollo, nella forma scritta di questo articolo, descriviamo anche come raccogliere il veleno dalle specie che sputano veleno in modo difensivo.Il protocollo quattro descrive come raccogliere il veleno direttamente dalle ghiandole velenifere mediante dissezione. Anestetizzare gli animali mediante esposizione all'anidride carbonica per 10 minuti. Inserisci tre perni nell'addome posteriore per tenere fermo l'insetto senza perforare le ghiandole velenifere.Praticare una breve incisione sulla linea mediana nella superficie ventrale dell'addome utilizzando un bisturi in miniatura. Usa le forbici in miniatura per estendere la linea mediana in direzione anteriore alla testa, avendo cura di tagliare solo l'esoscheletro e di non danneggiare le strutture interne. Per esporre le strutture interne, eseguire più tagli laterali che si estendono dall'incisione della linea mediana al lato dell'insetto.L'esoscheletro ventrale tra ogni due tagli può quindi essere appuntato all'indietro per rivelare le strutture interne. Inondare il vassoio di dissezione utilizzando una soluzione salina fino a quando l'insetto non è sommerso, consentendo alle strutture interne di galleggiare e di essere visualizzate più facilmente. Le ghiandole velenifere appariranno come strutture allungate traslucide che si estendono su ciascun lato del canale alimentare.Utilizzando pinzette e microforbici, rimuovere con cura il tessuto connettivo e nervoso e la trachea, cercando di non rompere il canale alimentare o le ghiandole velenifere. La ghiandola principale è riconoscibile per la sua struttura caratteristica, con lobi anteriori e posteriori e due dotti che si incontrano all'ilo. Per gli insetti assassini, e forse per altri eterotteri, quasi tutte le tossine sono immagazzinate nei lumi dei due lobi della ghiandola principale.Pertanto, dopo aver liberato la ghiandola principale dalla trachea e dal tessuto connettivo, i due dotti che partono dall'ilo possono essere tagliati e la ghiandola velenifera principale può essere raccolta. Se si desidera anche la ghiandola accessoria, di solito è strettamente opposta all'intestino e può essere identificata in modo inequivocabile tracciando i dotti dall'ilo. In ogni caso, fare attenzione a non rompere prematuramente le ghiandole e a non perdere il veleno nella soluzione salina circostante.Se i lobi della ghiandola principale devono essere separati, farlo rapidamente dopo la rimozione dalla soluzione salina e procedere immediatamente alla raccolta del contenuto dei lumi della ghiandola, come descritto nei passaggi 4.6 e 4.7 del manoscritto. I risultati variano a seconda dell'esatto sottoprotocollo e della specie di insetto utilizzata. Il primo e il secondo sottoprotocollo presentati in questo video hanno mostrato come raccogliere le tossine del veleno rispettivamente mediante elettrostimolazione e molestie.Entrambi questi metodi producono in genere un liquido concentrato contenente circa 50-250 milligrammi per mil di proteine e oltre 100 componenti a base di proteine, tra cui enzimi, tossine che formano i pori e peptidi. Il vantaggio principale di entrambi questi protocolli è che sono rapidi, non letali e il veleno non è contaminato dal tessuto ghiandolare. Il più grande svantaggio per la raccolta mediante elettrostimolazione o molestie è che la fonte ghiandolare del veleno ottenuto è sconosciuta e il contenuto proteico del veleno raccolto può differire, a seconda del protocollo.Inoltre, l'elettrostimolazione e le molestie non sono efficaci per tutte le specie predatrici di eterotteri. Nell'ultimo sottoprotocollo, abbiamo mostrato come sezionare le ghiandole velenifere gonfie per raccogliere direttamente le tossine. Questa tecnica produce anche un cocktail di proteine diverse, anche se in questo caso le tossine del veleno possono mostrare una certa contaminazione con il tessuto ghiandolare.Tuttavia, un vantaggio della raccolta delle tossine dalle ghiandole sezionate è che il compartimento ghiandolare di origine è noto esattamente. In conclusione, incoraggiamo i ricercatori a selezionare un metodo di raccolta appropriato alla loro domanda di ricerca. Ad esempio, le indagini sulla biologia dell'uso del veleno all'interno di una specie trarranno vantaggio dall'impiego di più tecniche di raccolta.Per gli studi di bioprospezione, un unico metodo per la raccolta di veleni da più specie può essere più economico, a seconda dello specifico disegno sperimentale. Speriamo che questo video e l'articolo scritto che lo accompagna facilitino i ricercatori a raccogliere il veleno da insetti assassini e altri insetti eterotteri, che è un prerequisito per comprenderne la composizione, la bioattività e l'evoluzione.

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Questo articolo fornisce un protocollo per l'estrazione di veleno da ragni con stimolazione elettrica al fine di 1) condurre la caratterizzazione proteomica, 2) stimolare veleno espressione genica della ghiandola, e 3) effettuare studi funzionali dei veleni. Questa è seguita da una descrizione di microdissections ghiandola veleno per studi di espressione genica.

Estrazione di Venom Venom e Gland Microdissections da Spiders per proteomica e analisi trascrittomica

Descriviamo un metodo per raccogliere in modo efficiente l'emolinfa quantificabile da piccoli artropodi per analisi successive.

Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

Questo protocollo descrive il saggio di alimentazione obbligata per valutare l'effetto potenzialmente tossico di un fitochimico sulle larve di insetti lepidotteri. Si tratta di un test biologico per insetti altamente scalabile, facile da ottimizzare la dose subletale e letale, l'attività deterrente e l'effetto fisiologico. Questo potrebbe essere utilizzato per lo screening di insetticidi ecologici.

Sviluppo di un sistema di dosaggio per l'alimentazione per la valutazione dell'effetto insetticida di sostanze fitochimiche su Helicoverpa armigera

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Mantenimento in cattività ed estrazione del veleno di Tityus serrulatus (scorpione giallo brasiliano) per la produzione di antidoto

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Raccolta le tossine veleno da Assassin Bugs e altri insetti Heteropteran

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