Metodi per la scoperta di nuovi composti modulando un recettore dell'acido Gamma - aminobutirrico tipo una neurotrasmissione

L'obiettivo generale di questo video è quello di illustrare una cascata di screening che consente la scoperta di nuovi ligandi del recettore GABA-A. Il vantaggio di utilizzare il legame con il radioligando, la registrazione elettrofisiologica negli ovociti di xenopus e nelle fette di cervello di roditore in modo letterale è che il profilo del composto può essere migliorato. Infine, vengono identificati sottotipi potenti, composti selettivi ed efficaci.

Questa dimostrazione sarà eseguita da Kumico Kambara e Jenna Tognaccini, nonché da Sonia e Daniel Bertrand di HiQScreen e Marie Claire Pflimlin di Roche. Iniettare da 10 a 50 nanolitri della soluzione contenente plasmide utilizzando un ago per microiniezione in vetro con un diametro della punta fino a 100 micrometri montato su un micromanipolatore dotato di un sistema di espulsione a pressione o di un sistema di iniezione automatizzato. Per iniziare questa procedura, mantenere gli ovociti a 17 gradi Celsius per prevenire l'espressione di proteine da shock termico.

Conservare la micropiastra in un'area di stoccaggio termicamente controllata. Quindi, sciogliere i composti in esame, che sono risultati positivi nel saggio di legame in OR2, a 0,1 e 1000 micromolari per registrazioni elettrofisiologiche e smaltirli in una piastra di polipropilene a fondo piatto a 96 pozzetti. Per eseguire la registrazione con pinza di tensione a due elettrodi, posizionare una piastra contenente gli ovociti sul sistema automatizzato.

Programmare il sistema di registrazione automatizzato utilizzando l'interfaccia basata su icone con questo schema per la determinazione appropriata della relazione tra attività di concentrazione. Per l'adattamento della curva, utilizzando la curva di attivazione della concentrazione illustrata, tracciare l'ampiezza corrente in funzione del logaritmo della concentrazione dell'agonista. Per la registrazione elettrofisiologica, mantenere il cervello in una soluzione di dACSF gorgogliata con carbogeno a temperatura ambiente.

Quindi, sezionare la formazione ippocampale sinistra con una spatola fine. Successivamente, sezionare dei vetrini trasversali di 400 micrometri di spessore dalla parte mediana dell'ippocampo con un tritatessuto. Utilizzando un pennello, trasferire le fette nella camera di registrazione e mantenerle a temperatura ambiente per 45 minuti.

Successivamente, perfondere le fette con rACSF gorgogliato con carbogeno a 35 gradi Celsius e a una velocità di 1,5 millilitri al minuto. Per registrare un singolo picco di popolazione, posizionare una fetta di cervello nella camera montata sul microscopio. Perfondere la fetta con rACSF alla velocità di tre millilitri al minuto.

Utilizzando l'estrattore per pipette, estrarre una micropipetta in vetro borosilicato con una resistenza di circa due megaohm. Riempire la micropipetta con una soluzione contenente due molari di cloruro di sodio e inserirla nel supporto della pipetta. Posizionare la micropipetta di registrazione nello strato piramidale nella regione CA1 della fetta ippocampale utilizzando il micromanipolatore destro.

Successivamente, posizionare un elettrodo bipolare di platino iridio isolato nel supporto sul micromanipolatore sinistro. Posizionare l'elettrodo di stimolazione nei collaterali di Schaffer nella regione CA1 della fetta ippocampale utilizzando il micromanipolatore sinistro. Utilizzando il generatore di stimolo, erogare un impulso di corrente all'elettrodo di stimolazione ogni 30 secondi e aumentare gradualmente la forza di stimolazione fino a quando non appare un picco di popolazione.

Regola l'intensità dello stimolo per evocare un picco di popolazione corrispondente al 45% dell'ampiezza massima che può essere ottenuta. Per eseguire l'inibizione dell'impulso accoppiato, erogare due impulsi di corrente all'elettrodo di stimolazione ogni 30 secondi utilizzando il generatore di stimolo. Imposta l'intensità dello stimolo in modo che evochi un picco di popolazione corrispondente al 45% dell'ampiezza massima.

Per testare i composti, effettuare diluizioni dei composti da testare in ACSF in modo che la concentrazione finale di DMSO non sia superiore allo 0,1%Aggiungere DMSO alla soluzione di controllo alla stessa concentrazione di quella nella soluzione composta. Registrare un picco di popolazione di polso singolo o accoppiato evocato dalle stimolazioni collaterali di Schaffer ogni 30 secondi per almeno 30 minuti. La forma del picco della popolazione dovrebbe essere stabile durante questo periodo di riferimento.

Successivamente, preparare un becher con rACSF carbogenato contenente una concentrazione fissa del composto da testare e perfondere la fetta ippocampale con la soluzione durante la registrazione di picchi di popolazione di polso singolo o appaiato. Inoltre, valutare il recupero dall'effetto composto perfondendo la fetta con rACSF carbogenato senza il composto. Qui è mostrata una rappresentazione schematica di una fetta di ippocampo di ratto, i collaterali di Schaffer originati dagli assoni delle cellule piramidali CA3 che si proiettano sull'arborizzazione dendritica dei neuroni piramidali CA1.

Le micropipette sono state posizionate nello strato piramidale per registrare i picchi di popolazione e nello strato radiato per le registrazioni dendritiche dei potenziali postsinaptici eccitatori di campo. L'elettrodo di stimolazione è stato posizionato all'interno dei collaterali di Schaffer. Questa figura mostra i picchi di popolazione evocati dagli stimoli accoppiati applicati attraverso lo stesso elettrodo stimolante a un intervallo di 20 millisecondi.

La risposta della popolazione al secondo stimolo è di ampiezza inferiore a quella della risposta al primo stimolo. Picchi di popolazione sono stati registrati in assenza e presenza di beta CCM, un recettore GABA A non selettivo NAM. Beta CCM ha aumentato l'ampiezza del secondo picco di popolazione bloccando parzialmente qualsiasi inibizione gabaergica feed-forward.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la farmacocinetica, l'occupazione e l'efficacia dei recettori in vivo e la farmacologia della sicurezza, al fine di rispondere a ulteriori domande, come il potenziale di sviluppo clinico dei composti identificati.