Name: Metodi per la scoperta di nuovi composti modulando un recettore dellacido Gamma - aminobutirrico tipo una neurotrasmissione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Scopri un protocollo di screening per identificare nuovi ligandi selettivi per i recettori GABA A utilizzando oociti di Xenopus e fette di cervello di roditore. Questo metodo combina binding del radioligando e registrazioni elettrofisiologiche per ottimizzare il profilo dei composti.

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Gli autori ringraziano Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab e Marie Claire Pflimlin da Roche e Tifany Schaer e Deborah Paolucci da HiQScreen per la loro eccellente assistenza tecnica.

Xenopus laevis sono ospitato e gestito secondo le direttive di animale del Canton Ginevra.
1. Radioligand Binding
<ol><li>
Preparazione del piatto dosaggio
	<ol>
<li>Preparare 1,5 L di tampone di dosaggio con 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl e 15 mM Tris; regolare il pH con HCl a 7,4.</li>
		<li>Preparare i composti da sottoporre a 50.76 µM (ad es., un composto a 10 mM in un 980 µ l di tampone di dosaggio in una microcentrifuga 5 µ l). Mescolare bene usando una macchina vortice ad alta velocità per 2 – 5 s.</li>
		<li>Preparare una pre-diluizione del flumazenil composto di riferimento di pipettaggio 1 µ l del composto (10 mM) a 1.970 µ l di tampone di dosaggio. Mescolare bene usando una macchina vortice ad alta velocità per 2 – 5 s.</li>
		<li>Diluire una soluzione di riserva di flumazenil [3H] con il tampone di dosaggio a 4 ° C a 4 nM in un tubo in polipropilene da 50 mL.</li>
		<li>Pipettare 50 µ l/pozzetto di tampone del saggio nelle colonne 1 e 3 – 11 di una micropiastra a 96 pozzetti come mostrato nel layout della piastra rappresentato nella Figura 2.</li>
		<li>73,2 µ l dei composti diluito a 50.76 µM (Vedi punto 1.1.2) nella colonna 12 della piastra.</li>
		<li>Diluire ciascun composto, utilizzando una progressione geometrica sopra 9 gradini (1E-10 – 1E–06 M), con un 23,12 µ l di trasferimento e riempire colonne 3 – 11. Mescolare accuratamente la diluizione. Cambiare la punta dopo ogni diluizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluire le membrane cellulari
	<ol>
<li>Scongelare le membrane delle cellule precedentemente isolate da un overesprimenti HEK293 umano del recettore GABAA (0.025 – 0,15 mg/mL) per ottenere 80 mL a temperatura ambiente (TA) e trasferire la sospensione nel buffer di dosaggio a 4 ° C.</li>
		<li>Risospendere la soluzione di membrana ancora a 4 ° C con un omogeneizzatore del tessuto per 30 – 40 s a 10.000-12.000 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluire il diazepam per il controllo di legame aspecifico (NSB)
	<ol>
<li>Diluire una soluzione di riserva di diazepam 4 mM con il tampone di dosaggio ad una concentrazione di 40 µM in 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Avviare la reazione
	<ol>
<li>Pipettare 50 µ l di 4 nM [3H] flumazenil in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti e conservarla in un contenitore di acqua ghiacciata.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l della preparazione di membrane sottotipo recettoriale GABAA per avere una concentrazione di proteina di 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Pipettare 50 µ l di diazepam di 40 µM nella colonna 2.</li>
		<li>Incubare la piastra per 1h sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di tampone di dosaggio in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti filtro di separazione a membrana successive e misura di radioattività e interrompere la reazione in seguito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fermare la reazione
	<ol>
<li>Preparare un tampone di lavaggio con 50 mM Tris-HCl, pH 7.4.</li>
		<li>Filtrare la soluzione mediante un harvester cella 96 pozzetti. Lavare la piastra 3 x con 300 µ l di tampone di lavaggio ghiacciata per pozzetto.</li>
		<li>Sigillare il fondo del piatto con una pellicola di plastica e aggiungere 40 µ l di cocktail per il liquido di scintillazione scintillazione contando ogni bene e pulire con etanolo 70%.</li>
		<li>Scuotere delicatamente la piastra per almeno 1 h a TA. Lasciate riposare per almeno un'altra ora a TA.</li>
		<li>Misurare la radioattività (in CPM) inserendo la piastra su un contatore di scintillazione. Consentire una misurazione per 3 min per pozzetto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi dei dati
	<ol>
<li>Determinare che la media per le 8 replica di legame aspecifico (NSB) e l'associazione totale (TB) come pure per quanto riguarda i duplicati o triplici copie dei campioni. Calcolare il legame specifico % (SB) per la media di ogni campione secondo la seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Qui, totale SB = la media TB meno il dire NSB.</li>
		<li>Trama in ascissa il SB % versus in ordinata le concentrazioni dell'inibitore. Inserire i dati utilizzando l'equazione di analisi concorrenza singolo sito: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Qui, y = la % di SB, A = minimo di y, B = il numero massimo di y, C = la IC50, X = il log10 della concentrazione del composto concorrente, D = la pendenza della curva (un coefficiente di Hill).</li>
		<li>Calcolare l'affinità di legame (Ki) usando la mezza concentrazione inibitoria massima (IC50), la costante di dissociazione (Kd) di flumazenil [3H] sulle rispettive membrane9e la concentrazione di [3H] Flumazenil nell'analisi secondo la seguente equazione utilizzando dati: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. recettore espressione e registrazioni in ovociti di Xenopus
<ol><li>Ovaie di raccolta e preparazione degli ovociti
	<ol>
<li>Preparare la soluzione sterile di Barth con 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7h2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4h2O e 0,41 mM CaCl2.6h2O, a pH 7,4 , completati con 100 unità/mL di penicillina, 100 µ g/mL streptomicina e 0,25 µ g/mL di amfotericina b.</li>
		<li>Preparare il supporto di x OR2 1 (nessun CaCl2) con 88,5 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6h2O, a pH 7,4.</li>
		<li>Sacrificio una Xenopus Laevis femmina di anestesia profonda per 20 min in raffreddato Tricaina metansolfonato (ad una concentrazione di 150 mg/L, regolata a pH 7,4) e bicarbonato di sodio (300 mg/L) seguita dalla decapitazione.</li>
		<li>Raccogliere le ovaie rapidamente con pinze e forbici pulite e metterli in 2 di-Petri (10cm) riempito con 40 mL di soluzione di Barth e antibiotici/antimicotici: 1x.</li>
		<li>Conservare le ovaie non dissociato per fino a 2 settimane in soluzione di Barth a 4 ° C.</li>
		<li>Per la dissociazione, tagliare le ovaie con una lama di rasoio pulita in piccole frazioni (1 – 2 cm3) e incubare li in 50 mL di mezzo di OR2 senza CaCl2 (OR2-noCaCl2) contenente collagenasi di 0,2% (tipo I) alle 17 – 19 ° C in un filatore di 100 mL matraccio con un'agitazione lenta per 4 – 5 h. Verificare che la barra magnetica è posto circa 3 – 5 cm sopra il fondo del matraccio spinner per evitare di schiacciare gli ovociti.</li>
		<li>Dopo 4 – 5 h, verificare che la maggior parte degli ovociti sono liberata dal loro follicolo (cioè, che nuotano intorno individualmente). Lavare 5X con 200 mL di OR2 completati con 1,8 mM CaCl2.</li>
		<li>Trasferire la defolliculated ovociti di Petri (10cm) riempito con soluzione di Barth e antibiotici/antimicotici e tenerli almeno una notte a 17 ° C prima dell'iniezione di cDNA o mRNA.</li>
		<li>Il giorno successivo, seleziona, sotto un binocolo, un ovocita sano che presenta una chiara e distinta animale contro un palo vegetal (marrone scuro per il polo animale contro giallo chiaro per il palo vegetal). Utilizzare pipette Pasteur pulite e gettare gli ovociti uno per uno in una piastra ben di 96-iniezione conica sterile. Nota: non è richiesta nessuna particolare attenzione nel posizionamento degli ovociti per le iniezioni di mRNA; considerando che, per le iniezioni di cDNA, è indispensabile per orientare gli ovociti con il polo animale rivolto verso l'alto.</li>
	</ol></li>
	<li>iniezione automatica mRNA o del cDNA
	<ol>
<li>Sintetizzare i mRNAs utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni consigliate. Pulire gli strumenti e la tabella con RNAsi e indossare i guanti di protezione appropriati. Nota: La qualità del mRNA è determinante per ottenere una buona espressione, ed è indispensabile per evitare la degradazione di mRNA durante la procedura di iniezione.</li>
		<li>Preparare i cDNAs utilizzando un kit disponibile in commercio e sciogliere la quantità desiderata in acqua bidistillata ad una concentrazione di 0,2 µ g / µ l.</li>
		<li>Iniettare 10 – 50 nL di soluzione di mRNA ad una concentrazione di 0,2 µ g / µ l, o 10 nL di cDNA soluzione ad una concentrazione da 0,02 – 0,2 µ g / µ l, preferibilmente in lotti di 95 ovociti.</li>
		<li>Per membrana proteine che richiedono più subunità (cioè, i recettori eteromerici α1β2γ2 GABAA ), mescolare il corrispondente mRNA o cDNAs nel rapporto desiderato (cioè, 1:1:1 o 1:10:1).</li>
		<li>Mantenere l'ovocita a 17 ° C al fine di prevenire l'espressione di heat shock proteins gli ovociti; conservare la micropiastra in un'area di deposito termo-controllata.</li>
		<li>Sciogliere i residui della prova che erano risultati positivi nel test associazione a OR2 a 0,1 – 1.000 µM per registrazioni elettrofisiologiche e li smaltire in una lastra in polipropilene fondo piatto 96 pozzetti.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmidi per l'espressione
	<ol>
<li>Seguire i manuali di istruzioni dei kit disponibili in commercio per la sintesi di mRNA con promotori batterici T7 o T6 e fare 20 µ l di una soluzione a 0,2 µ g / µ l in acqua RNAsi-libera.</li>
		<li>Preparare almeno 20 µ l di una soluzione contenente un vettore di espressione dell'eucariota per l'espressione di cDNA, in genere a 0,2 µ g / µ l, disciolto in acqua bidistillata.</li>
	</ol></li>
	<li>Microiniezione nell'ovocita e la visualizzazione della sua qualità
	<ol>
<li>Iniettare 10 – 50 nL di soluzione contengono il plasmide (Vedi punto 2.3.1 o 2.3.2) utilizzando un ago di micro-iniezione di vetro con un diametro di punta che vanno fino a 100 µm montata su un micromanipolatore equipaggiato con un sistema di espulsione di pressione o con un sistema automatizzato ad iniezione. Nota: Nell'esempio discusso qui, gli ovociti vengono iniettati con i lotti di 95 con un sistema automatizzato adatto ad uso con cDNA o mRNA.</li>
		<li>Riempire l'ago per iniezione con 1 µ l di un colorante come il blu di metilene all'1% e iniettare gli ovociti mediante la procedura standard (sia nel nucleo per cDNA o nel citoplasma per mRNA).</li>
		<li>Smaltire gli ovociti iniettati per circa 1 minuto in acqua bollente. Tagliare gli ovociti a metà con una lama di rasoio sotto un binocolo. Nota: Il colorante rimane localizzato come mostrato in Figura 3E, permettendo un'osservazione precisa dell'iniezione.</li>
	</ol></li>
	<li>Registrazioni di due elettrodi tensione morsetto
	<ol>
<li>Posizionare la piastra ben contenente gli ovociti sul sistema automatizzato, che utilizza il principio illustrato nella Figura 4. Nota: In contrasto con il sistema del morsetto di patch illustrato nella Figura 5, il potenziale di membrana vero della cella viene letto tramite l'elettrodo di tensione.</li>
		<li>Programmare il sistema di registrazione automatizzata utilizzando l'interfaccia basata su icone con, ad esempio, lo schema illustrato nella Figura 6 per la determinazione del rapporto di attività di concentrazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Adattamento alla curva
	<ol>
<li>Analizzare i risultati utilizzando il software appropriato, utilizzando la curva di attivazione illustrato concentrazione, trama l'ampiezza corrente in funzione del logaritmo della concentrazione dell'agonista.</li>
		<li>Osservare la curva sigmoidale che può successivamente essere equipaggiata con l'equazione empirica di collina nel modulo: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Qui, Y= la frazione di corrente evocati, CE 50 = la concentrazione per un 50% di attivazione, x = la concentrazione del composto, nH = il coefficiente di Hill o la cooperatività apparente.</li>
		<li>Normalizzare le correnti ad un'unità dividendo l'ampiezza di ogni risposta contro il valore registrato al più alta concentrazione di analizzare i dati ottenuti da una serie di celle.</li>
		<li>Determinare la media e gli errori standard e realizzare l'adattamento delle curve utilizzando software come standard disponibili.</li>
	</ol></li>
</ol>3. elettrofisiologiche registrazioni nelle fette del cervello
Nota: Fette Hippocampal del ratto sono preparati in conformità con le linee guida nazionali e istituzionali.
<ol><li>
Preparazione delle fette dell'ippocampo
	<ol>
<li>Preparare il liquido cerebro-spinale artificiale dissezione (dACSF) con 124 mM NaCl 124, 2,5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2mm MgSO4.7h2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26mm NaHCO3, glucosio di 10 mM e 4 mM saccarosio gassificato in bottiglia con una miscela di 95% O2 e 5% CO2.</li>
		<li>Preparare il registrazione fluido cerebro-spinale artificiale (rACSF) con 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2mm MgSO4.7h2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25mm NaHCO3e 10 millimetri di glucosio gassificato in bottiglia con una miscela di 95% O2 e 5% CO2.</li>
		<li>Anestetizzare i ratti utilizzando una miscela di 2,5% isoflurane e ossigeno puro e decapitare loro.</li>
		<li>Tagliare il cuoio capelluto seguendo la linea mediana con un bel paio di forbici. Tagliare il cranio lungo la linea mediana senza danneggiare il tessuto sottostante. Rimuovere il cranio con le pinzette e utilizzare una spatola fine per scavare il cervello.</li>
		<li>Posizionare il cervello nella soluzione dACSF gasati a RT e sezionare la formazione hippocampal di sinistra con una spatola fine.</li>
		<li>Tagliare in sezioni trasversali (spessore 400 µm) dalla parte media dell'ippocampo con un elicottero di tessuto e trasferirli alla camera di registrazione con l'uso di un pennello di pittura. Mantenere le fette a RT per 45 min.</li>
		<li>Irrorare le fette con la rACSF gasati a 35 ° C e a una velocità di 1,5 mL/min bolla la soluzione con una miscela di 95% O2 e 5% CO2. Nota: Dopo questo passaggio, le fette sono pronte per gli esperimenti elettrofisiologici.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Registrazione di spike singola popolazione
	<ol>
<li>Mettete una fetta di cervello nella camera microscopio-montato.</li>
		<li>Irrorare la fetta a una velocità di 3 mL/min con rACSF.</li>
		<li>Tirare una micropipetta di vetro borosilicato con l'estrattore di pipetta avendo una resistenza di MΩ ~ 2. Nota: Questa micropipetta è usata come un elettrodo di registrazione e viene collegata elettricamente all'amplificatore.</li>
		<li>Riempire la micropipetta con una soluzione contenente 2 M NaCl e inserirlo nel supporto pipetta dell'amplificatore.</li>
		<li>Posizione la micropipetta di registrazione nel pyramidale corneum nella regione CA1 di fettine di ippocampo utilizzando il micromanipolatore giusto. Nota: Il percorso è rappresentato schematicamente nella Figura 7.</li>
		<li>Posizionare un elettrodo di platino/iridio bipolare isolato nel supporto sul micromanipolatore di sinistra. Nota: Questo elettrodo viene utilizzato come l'elettrodo di stimolazione ed è collegato elettricamente al generatore di stimolo.</li>
		<li>Posizionare l'elettrodo di stimolazione nei collaterali di Schaffer nella regione CA1 della fetta hippocampal utilizzando il micromanipolatore giusto. Nota: Il percorso è rappresentato schematicamente nella Figura 7.</li>
		<li>Fornire un impulso di corrente all'elettrodo di stimolazione utilizzando il generatore di stimolo ogni 30 s (durate 100 µs, a partire da 10 µA) e aumentare gradualmente l'intensità di stimolazione fino a un picco di popolazione (PS) viene visualizzato.</li>
		<li>Regolare l'intensità di stimolo per evocare un PS corrispondente al 45% dell'ampiezza massima che può essere ottenuta. PSs sono filtrati a 2,4 KHz e digitalizzati a 20 KHz utilizzando l'amplificatore di segnale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inibizione di accoppiare-impulso
	<ol>
<li>Preparare le fettine di cervello (punto 3.1) e procedere come descritto in precedenza (punti 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Fornire due impulsi di corrente (100 µs durate a un intervallo di 20 ms) all'elettrodo di stimolazione ogni 30 s utilizzando il generatore di stimolo. Regolare l'intensità di stimolo per evocare un PS corrispondente al 45% dell'ampiezza massima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Compound test
	<ol>
<li>Effettuare diluizioni dei composti da testare in ACSF gasati affinché la concentrazione finale di DMSO non superiore allo 0,1%.</li>
		<li>Aggiungere alla soluzione di controllo alla stessa concentrazione di quella nella soluzione composta DMSO.</li>
		<li>Registrare un singolo (punto 3.2) o un PS di accoppiare-impulso (punto 3.3) evocato da stimoli collaterali di Schaffer ogni 30 s per almeno 30 min. La forma di PS deve essere stabile durante questo periodo di previsione.</li>
		<li>Preparare un becher con gasati rACSF contenente una concentrazione fissa del composto da testare.</li>
		<li>Irrorare le fettine di ippocampo con questa soluzione mentre ancora registrando il singolo o accoppiare-impulso PS.</li>
		<li>Valutare il recupero dall'effetto composto irrorando la fetta con gasati rACSF senza il composto. Nota: Per effetti reversibili, il PS Torna alla sua forma iniziale osservato durante il periodo della linea di base prima dell'applicazione di composto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi dei dati
	<ol>
<li>Media le tracce di PS registrata durante l'esperimento in blocchi di 4 utilizzando il software di analisi dati.</li>
		<li>Misurare le ampiezze di PS delle tracce media.</li>
		<li>Normalizzare le ampiezze come percentuale dei valori di baseline registrato 10 min prima che irrora un composto.</li>
		<li>Esprimere i dati come media ± SEM</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori Frédéric Knoflach e Maria-Clemencia Hernandez sono dipendenti di F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basilea, Svizzera, una società farmaceutica. L'autore Daniel Bertrand è un dipendente di 6 HiQScreen Sàrl, rte de Compois, 1222 Vésenaz Ginevra, fornendo servizi di screening per le aziende farmaceutiche.

Lo sviluppo di nuovi composti attivi a un canale ionico legante-gated come i recettori GABAA richiede l'utilizzo di approcci multipli. In genere, il primo passo è spesso condotto mediante analisi obbligatorie; Tuttavia, tali misure sono insufficienti per caratterizzare l'attività fisiologica del composto o sua farmacologia preciso. In particolare, un composto che si lega a un recettore può migliorare o inibire la sua funzione o anche non produrre alcun effetto funzionale (tacere) (cioè, legano al recettore senza modificare la sua funzione). Quindi, un test funzionale è necessario per una caratterizzazione completa composta.
Saggi di binding: Il vantaggio principale del dosaggio associazione è che può essere condotta in modo efficiente su un gran numero di campioni che vanno fino a diverse migliaia e che fornisce affinità di legame per molecole attive. Come descritto nel presente documento, il primo passo consiste nello stabilire un metodo per la valutazione dei sottotipi del ricevitore desiderato. Vale a dire, mentre l'associazione può essere condotta su recettori nativi da frazioni o intero cervello, tale metodo impedirà la determinazione delle affinità a sottotipi recettoriali specifici. Pertanto, è necessario utilizzare sistemi ricombinanti per molecole schermo presso la destinazione desiderata. Al giorno d'oggi, una trasfezione transiente o stabile dei cDNA subunità del recettore desiderata in linee cellulari offre un metodo efficiente e affidabile per esprimere i sottotipi del ricevitore di interesse (ad es., GABAA α5β3γ2). Associazione tradizionale saggi fanno uso di radioligands, ma al giorno d'oggi le tecniche sono disponibili che evitare l'inconveniente di movimentazione radioattività (ad es., basati sulla fluorescenza quantitativa ligand-legantesi).
Espressione funzionale in un sistema host: Per esprimere geni in un sistema host, la sequenza di codificazione di interesse deve essere inserita in un plasmide contenente i promotori adeguati. In genere, per la sintesi di mRNA in vitro , i promotori di T7 o T6 batterici vengono utilizzati. Per un'espressione di cDNA, la trascrizione del gene di interesse deve essere regolata da un promotore dell'eucariota come CMV (citomegalovirus) o equivalente. Al giorno d'oggi, diversi plasmidi, compresi i due promotori (cioè, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), sono disponibili permettendo una sintesi in vitro di mRNA o un'espressione di cDNA come mostrato in Figura 15. Un'espressione dei recettori GABAA possa essere ottenuta fedelmente nelle linee cellulari o in ovociti di Xenopus . I principali vantaggi di questi ultimi sono la mancanza di espressione del recettore endogeno, la semplicità di manipolazioni e la disponibilità di un sistema automatizzato per micro-iniezioni e registrazioni. Le procedure descritte in questo protocollo illustrano l'efficienza del sistema automatizzato che consente l'iniezione di 96 ovociti in circa 7 minuti e non richiede nessuna abilità di micromanipolazione. Ricordando che un unico ovario da una Xenopus contiene tra 10.000-30.000 ovociti, è chiaro che un gran numero di misurazioni delle cellule può essere condotta su una singola preparazione. Inoltre, come un'espressione può essere condotta mediante iniezioni di cDNA, lo stessi plasmidi contenenti i geni di interesse che sono stati sviluppati per gli esperimenti di associazione possono essere utilizzati per una caratterizzazione funzionale senza la necessità di ulteriore biologia molecolare manipolazioni.
Data la sua grande dimensione e alta espressione di superficie, un singolo ovocita produce un numero di recettori che è approssimativamente equivalente a cellule confluenti in una capsula di Petri da 35 mm. Tuttavia, un'iniezione e preparazione di ovociti rappresenta una frazione del costo di una linea cellulare, come gli esperimenti non richiedono un terreno di coltura specifico e manipolazioni sterili. L'attivazione di un singolo canale di GABAA produce pochi picoamperes (10-12) e le correnti che vanno fino a decine di microampere (10-6) sono facilmente registrate in un singolo oocita, che conferma l'attività concomitante di diversi milioni di recettori durante una singola risposta.
Un primo passo nella caratterizzazione dei canali ionici ligando è spesso la determinazione dell'apparente affinità dei recettori. Gli esperimenti che devono essere condotte sono costituiti da applicando una serie di impulsi di prova breve agonista e tramando l'ampiezza dell'evocati corrente o, in alcuni casi, l'area sotto la curva (AUC) in funzione del logaritmo della concentrazione dell'agonista. Come è facilmente fattibile da microinject plasmide diverse concentrazioni e rapporto nello stesso batch di ovociti, questo sistema di espressione è particolarmente appropriato per tale caratterizzazione. Inoltre, un confronto lotto ha rivelato un alto grado di stabilità per diversi CE50s. L'influenza della composizione in subunità su affinità apparente del ricevitore è visualizzato prontamente usando una trama di ragno, come esemplificato nella Figura 10.
I risultati del morsetto tensione due elettrodi ottenuti in ovociti di Xenopus sono spesso confrontati con le registrazioni effettuate usando elettrodi di patch clamp. Considerando che andrebbe oltre lo scopo di questo lavoro per andare in un confronto dettagliato tra questi due sistemi, possono essere esaminati alcuni punti. Mentre un morsetto di patch in cellule offre vantaggi per una caratterizzazione biofisica con un'applicazione veloce di droga, i requisiti sono più complessi di quelli delle registrazioni del due-elettrodo in ovociti di Xenopus . Una difficoltà prima e non trascurabile è l'espressione di una data proteina con la necessità di una coltura cellulare, un transitorio o trasfezione stabile e l'identificazione delle cellule che esprimono il costrutto desiderato. Inoltre, è indispensabile esaminare il possibile contributo dell'espressione endogena nella cella considerata. Inoltre, una registrazione di morsetto di patch richiede una persona esperta per condurre la micromanipolazione sotto un microscopio ad alto ingrandimento, mentre quella persona deve anche eseguire un'analisi adeguata durante l'esperimento per valutare, ad esempio, la qualità della guarnizione, la resistenza di accesso ecc In contrasto, un morsetto di tensione del due-elettrodo registrazione, specialmente uno utilizzando un sistema elettrofisiologico automatico, non richiede competenze specifiche e può essere condotta dai tecnici di laboratorio.
Quando l'acquisizione di un set-up elettrofisiologico, costo considerazione è certamente un fattore importante che deve essere attentamente analizzati. Ad esempio, mentre il costo di un sistema automatizzato è relativamente alto, un confronto più vicino rivela che l'installazione di un rig elettrofisiologico completo include l'acquisto di attrezzature quali buone micromanipolatori, una lente binoculare, un amplificatore, una perfusione sistema e un tavolo antivibrazione, mentre anche l'acquisizione di dati e l'esecuzione di un'analisi. Un confronto dei costi tra un due-elettrodo tensione morsetto set-up contro un set-up di patch clamp rivela ulteriormente discrepanze. Inoltre, il sistema automatizzato offre il vantaggio di attrezzature completamente automatizzate e viene eseguito in automatico giorno e notte.
Le proprietà farmacologiche di un composto sono determinate dalla relativa modalità di azione sui recettori. Ad esempio, inibitori competitivi sono molecole che possono immettere la stessa associazione tasca, o ortosterici sito, come l'agonista stessa provoca un concorso. Inibitori non-competitivi sono composti che inibiscono i recettori interagendo in un altro sito e, nel caso di un canale ionico legante-gated, che possono inserire e bloccare il poro ionico, ad esempio. Andrebbe oltre lo scopo di questo lavoro per esaminare i diversi meccanismi di interazione, ma ulteriori informazioni possono essere ottenute da un libro di testo farmacologico e/o da altri lavori come Bertrand e di Bertrand22.
Nel caso di modulatori allosterici, il composto si lega a un sito che è distinto dal sito ortosterici, ma la presenza della molecola modifica la barriera energetica tra gli Stati attivi e altri. Modulatori allosterici positivi (PAMs) sono composti che riducono la barriera energetica da riposo allo stato attivo e, di conseguenza, migliorano l'effetto dell'agonista. Per caratterizzare gli effetti possibili di PAM, è, pertanto, necessario per determinare se un'esposizione al composto migliora la risposta per l'agonista e, in caso affermativo, a quale concentrazione. Gli esperimenti presentati in Figura 11 e Figura 14 illustrano protocolli che possono essere utilizzati con successo per la caratterizzazione di PAMs presso i recettori GABAA .
In alcuni casi, l'esposizione a PAM da solo potrebbe essere sufficiente per attivare i recettori. Tale attività può essere determinata da una leggera modifica del protocollo sperimentale presentato qui. Vale a dire, invece di utilizzare una co-applicazione del modulatore durante l'esposizione al GABA, il protocollo può essere modificato per l'applicazione di primo il composto da solo e quindi in presenza di GABA. Una caratterizzazione dell'attività agonista diretto avverrà tramite la determinazione dell'ampiezza della risposta evocata dal composto stesso e rispetto all'attuale GABA-evocati.
Esperimenti condotti nelle fette del cervello, come illustrato nella Figura 7, vengono utilizzati per confermare l'attività del composto a recettori nativi in un circuito inibitorio definitivo prima di andare avanti nei modelli animali e lungo il sentiero verso sperimentazioni cliniche. Il protocollo di registrazione e analisi di dati relativamente semplice permette la classifica dei più composti valutando il loro effetto modulatory differenziale sull'ampiezza di PS. Non specifici effetti di composti che non sono legati al sistema GABA possono anche essere rilevato (per esempio, quando sono osservati cambiamenti nella forma PS). Diretto, neurotrasmissione GABAergica può essere valutata in questi casi di misurare gli effetti dei composti su correnti postsinaptiche inibitorie (IPSCs) utilizzando le cellule intere patch clamp tecnica8.

Qui, presentiamo i protocolli per la scoperta di composti attivi sui recettori GABAA , dall'associazione alla fisiologia e alla farmacologia. Nella ricerca di nuove molecole specifiche per i recettori GABAA , è cruciale per definire, nel modo più preciso possibile, il sottotipo di interesse e la valutazione della specificità dei composti recentemente identificati (ad es., per una rassegna, Vedi Rudolph e Knoflach1o Sieghart2). Il percorso tipico in drug discovery e i passaggi che devono essere raggiunti sono illustrati nella Figura 1.
Analisi obbligatorie sono state e sono ancora in gran parte utilizzate come il primo passo nella scoperta della droga. Nel caso di recettori GABAA , sono ottimizzati per identificare i composti che si legano al sito di legame delle benzodiazepine, del recettore, dove associare farmaci terapeuticamente utili e sicuri. Altre tecniche, utilizzando fluorometrica imaging piastra lettore (FLIPR) membrana potenziale saggi basati su colorante rosso3, rilevano composti come i barbiturici che legano ad altri siti che sono meno desiderabili a causa del loro profilo di effetti collaterali indesiderato. Inoltre, i coloranti utilizzati direttamente possono attivare recettori GABAA , così in discussione l'utilità di questi saggi per drug discovery4. Analisi di associazione può fornire solo la prova che un determinato composto può essere associato a una classe di recettori specifici. In vitro saggi con le membrane cellulari sono utilizzati per identificare selettivo umani ligandi dei recettori GABAA α5β3γ2. Transitoriamente transfected le cellule HEK293 esprimendo l'umano GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 e α3β3γ2 recettori vengono utilizzate per preparare le membrane per queste analisi. L'effetto dei ligandi è rilevata misurando la scintillazione di flumazenil [3H] associati a recettori di membrana (un'inibizione del legame di flumazenil [3H]). Il vantaggio principale di questa tecnica è che una determinazione rapida ed efficiente dell'affinità al recettore di interesse composto-associazione viene fornita presso il recettore di interesse.
Gli studi funzionali sono essenziali per valutare l'attività funzionale dei composti e di proporre una spiegazione fisiologica e farmacologica dei meccanismi causato dall'associazione dei composti ai recettori. Oggi, è incontestato che funzionale dei recettori GABAA risultato dall'assemblaggio di cinque subunità attorno a un asse di pseudosymmetry formata dal poro ionico e risultato dall'assembly di cinque subunità identiche. La maggior parte dei recettori GABAA sono composti da due o più unità secondarie differenti. Il recettore importante del cervello GABAA , per esempio, è composta delle subunità α1, β2 e γ2 in una stechiometria di 2, 2 e 1 rispettivamente5,6. Una ricostituzione in un sistema host come gli ovociti di Xenopus o cellule HEK293 offre la possibilità di esplorare rapidamente le proprietà farmacologiche dei recettori.
Le proprietà farmacologiche dei composti sono poi Esplorate con registrazioni extracellulari nel cervello fette7. Questo metodo permette un'esplorazione dell'effetto dei composti sulla neurotrasmissione e fornisce un modo efficace per confermare gli effetti funzionali dei composti determinati in sistemi eterologhi a livello dei recettori nativi in generale ambiente di un neurone. Neurotrasmissione GABAergica è valutabile anche a livello molecolare, misurando gli effetti dei composti su correnti postsinaptiche inibitorie (IPSCs)8. Ma il protocollo usato qui e basate sulle cellule intere patch morsetto registrazioni nelle fette del cervello è più elaborato e produce una velocità di trasmissione inferiore.
Infine, la forza e debolezza in vitro screening cascata utilizzato per l'identificazione di ligandi selettivi per α5β3γ2 è discussi nella prospettiva di diverse tecniche e i loro limiti intrinseci. Questo lavoro dovrebbe fornire esperti e non esperti nel campo dei recettori GABAA una recensione utile la combinazione di approcci diversi in vitro utilizzata per affrontare la scoperta di nuovi modulatori di questi canali ionici ligando.

<table><tbody><tr><td>Attrezzatura generale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raccoglitore di celle a 96 pozzetti -(Filtermate 196)&nbsp;</td><td>Packard</td><td></td><td>Per filtrare membrane con radioligante legato Contatore</td></tr> a <tr><td>scintillazione liquida per micropiastre (Top Count NXT)</td><td>Contatore a scintillazione e luminescenza per micropiastre</td> <td>Packard</td><td></td></tr><tr><td>Contatore a scintillazione liquida per fiale (Beta-Couter 2500 TR)</td><td>Contatore a scintillazione e luminescenza per fiale</td> <td>Packard</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore di liquidi (Biomek 2000)</td><td>Coltro</td><td></td> <td>BeckmanPer preparare diluizioni composte</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific industries Inc.</td><td></td><td>Per miscelare soluzioni madre composte</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore tissutale (Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>Per risospendere le preparazioni di membrana</td></tr><tr><td>Software XLfit5</td><td>Microsoft Excel &nbsp; componente aggiuntivo di IDBS</td><td></td><td>Software di adattamento della curva</td></tr><tr><td>Smart Pull</td><td>UniPix-Estrattore</td><td></td> di <td>elettrodi</td></tr><tr><td>RoboInject</td><td>Sistemi multicanale-Iniezione</td><td></td> <td>automatizzata (ovociti Xenopus)</td></tr><tr>Sistemi <td>multicanale</td> <td>HiClamp-Pinza</td> <td>di tensione automatizzata (Xenopus Ovociti)</td><td></td></tr><tr>Sistemi <td>multicanale</td> <td>di estrazione dati-Dati</td><td></td><td> Software di analisi</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>Sistemi multicanale-Software</td><td></td> <td>di elaborazione dati</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Sistema di acquisizione dati a basso rumore</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 o equivalente</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Condizionatore di segnale programmabile</td></tr><tr><td>pClamp suite di programmi</td><td>Molecular Devices</td><td></td> Software <td>per l'acquisizione e l'analisi dei dati software</td></tr><tr><td>Tavolo Antivibraton&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>Per evitare vibrazioni dei microelettrodi&nbsp;</td></tr><tr><td>Patchstar Micromanipolatori</td><td>Scientifica</td><td></td><td>Per posizionare con precisione i microelettrodi nelle fette di cervello Gabbia di</td></tr><tr><td>Faraday</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Per isolare le registrazioni dal rumore</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD&nbsp;</td><td></td><td>Per preparare fette di cervello</td></tr><tr><td>Micropipetta in vetro borosilicato&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>Per registrare potenziali extracellulari in fette di cervello</td></tr><tr><td>Elettrodo di stimolazione a doppino intrecciato, fili di platino iridio</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Per stimolare le fette di cervello con la corrente</td></tr><tr><td>Generatore di stimolo per la stimolazione guidata da corrente e tensione</td> Sistemi <td>multicanale</td><td>STG4000</td><td>Fornisce la corrente all'elettrodo</td></tr> <tr><td>di stimolazionePlasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra per microtitolazione fondo rotondo</td><td>Corning</td><td>#3365</td><td>Utilizzato per il saggio di legame</td></tr><tr><td>GF/C micropiastra a 96 pozzetti con fondo filtrante in fibra di vetro con 1,2 &; m poresize, per saggi di prelievo cellulare utilizzando un filtro a pozzetto collettore sottovuoto&nbsp;</td><td>Packard&nbsp;</td><td>#6005174</td><td>utilizzato per il saggio di legame</td></tr><tr><td>Provette da 50 mL</td><td>Falcon</td><td>#352070</td><td>utilizzato per il test di legame</td></tr><tr><td>Provette Safe-lock 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>utilizzato per il test di legame</td></tr><tr><td>Provette Safe-lock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>utilizzato per il test di legame</td></tr><tr><td>Provette di spedizione 180 mL&nbsp;</td><td>Semadeni Europe AG</td><td>#3722</td><td>utilizzato per il saggio di legatura</td></tr><tr><td>Fiala di Pony Polietilene 6 mL&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>utilizzato per il saggio di legame</td></tr><tr><td>Top Seal&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#60051859</td><td>utilizzato per il test di legatura</td></tr><tr><td>Fiaschetta</td><td>Bellco BELLCO</td><td># 1965-00100</td><td>Fiaschetta</td></tr><tr><td>96&nbsp; Piastra a pozzetti (conica)</td><td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>Piastra di iniezione per gli ovociti</td></tr><tr><td>96&nbsp; Piastra a pozzetti (fondo piatto)</td><td>Corning (Vitaris Svizzera)</td><td>Piastra composta 3364-cor</td><td>per il</td></tr><tr><td>capillare</td> HiClamp Glass<td>Hilgenberg (Germania)</td><td>-</td><td>vetro borosilicato 1,2 D.E. 0,76 D.I. con preparazione di filamenti</td></tr><tr><td>RNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>per la sintesi</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>in vitroTampone di dosaggio: KCl 5 mM; CaCl2 1,25 mM; MgCl2 1,25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM Regolazione del pH con HCl a 7,4; conservare fino a 3 mesi a 4 °C.</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per il saggio di legame</td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio: Tris 50 mM -HCl pH 7,4; conservare a 4 °C.</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per il saggio</td></tr><tr><td>di legame Soluzione madre di composti in esame 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per il saggio di legame</td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per il saggio di legame</td></tr><tr><td>Diazepam 4 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per il saggio di legame</td></tr> <tr><td>[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in etanolo; conservare a -20 &deg; C</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per il saggio di legame</td></tr><tr><td>Microscint 40&nbsp;</td><td>Packard&nbsp;</td><td>#6013641</td><td>Utilizzato per il saggio di legame</td></tr><tr><td>Ultima Gold&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>Utilizzato per il test di legame</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>antibiotici / antimicotici</td></tr><tr><td>Collagenasi</td><td>Sigma</td><td>Sigma # C1030</td><td>Collagenasi Tipo I</td></tr><tr><td>Rnasi</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>Sali per liquido cerebrospinale artificiale (NaCl, KCl, ecc.)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preparazioni di membrane congelate da HEK293 transitorio o stabilmente trasfettato che sovraesprimono diversi sottotipi di recettori GABAA: &alfa; 1&beta; 3&gamma; 2, &alfa; 2&beta; 3&gamma; 2, &alfa; 3&beta; 3&gamma; 2, &alfa; 5&beta; 3&gamma;2. Vedi Ballard et al. 2009 per metodi dettagliati.</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per il saggio di legame</td></tr></tbody></table>

metodi per la scoperta di nuovi composti modulando un recettore dell'acido gamma - aminobutirrico tipo una neurotrasmissione

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Questa presenta manoscritto un protocollo dettagliato per lo screening composti a gamma-amminobutirrico acido digitare un recettori (GABAA) ed il relativo uso verso l'identificazione di nuove molecole attive nei saggi preclinici da un ricombinante in vitro recettore ai loro effetti farmacologici dei recettori nativi nelle fette del cervello del roditore. Per composti vincolante al sito del recettore delle benzodiazepine, il primo passo è quello di impostare una schermata principale che consiste di sviluppare analisi obbligatorie radioligand sulle membrane delle cellule che esprimono i principali sottotipi di GABAA . Poi, approfittando dell'espressione eterologa dei recettori GABAA roditore e umani in oociti di Xenopus o cellule HEK 293, è possibile esplorare, nelle analisi elettrofisiologiche, le proprietà fisiologiche del recettore diverso le proprietà farmacologiche dei composti identificati e sottotipi. Il sistema di ovociti di Xenopus sarà presentato qui, a partire con l'isolamento di ovociti e loro microiniezione con differenti mRNA, fino alla caratterizzazione farmacologica utilizzando due elettrodi tensione morsetti. Infine, le registrazioni condotte nelle fette del cervello del roditore saranno descritto utilizzati come secondario fisiologico test per valutare l'attività delle molecole alle loro recettori nativi in un circuito ben definito di un neurone. Registrazioni extracellulari utilizzando le risposte di popolazione dei neuroni multipli sono dimostrate unitamente alla domanda di droga.

Qui, presentiamo protocolli per scoprire composti attivi sui recettori GABAA , dall'associazione alla fisiologia e alla farmacologia.

Metodi per la scoperta di nuovi composti modulando un recettore dell'acido Gamma - aminobutirrico tipo una neurotrasmissione

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

L'obiettivo generale di questo video è quello di illustrare una cascata di screening che consente la scoperta di nuovi ligandi del recettore GABA-A. Il vantaggio di utilizzare il legame con il radioligando, la registrazione elettrofisiologica negli ovociti di xenopus e nelle fette di cervello di roditore in modo letterale è che il profilo del composto può essere migliorato. Infine, vengono identificati sottotipi potenti, composti selettivi ed efficaci.Questa dimostrazione sarà eseguita da Kumico Kambara e Jenna Tognaccini, nonché da Sonia e Daniel Bertrand di HiQScreen e Marie Claire Pflimlin di Roche. Iniettare da 10 a 50 nanolitri della soluzione contenente plasmide utilizzando un ago per microiniezione in vetro con un diametro della punta fino a 100 micrometri montato su un micromanipolatore dotato di un sistema di espulsione a pressione o di un sistema di iniezione automatizzato. Per iniziare questa procedura, mantenere gli ovociti a 17 gradi Celsius per prevenire l'espressione di proteine da shock termico.Conservare la micropiastra in un'area di stoccaggio termicamente controllata. Quindi, sciogliere i composti in esame, che sono risultati positivi nel saggio di legame in OR2, a 0,1 e 1000 micromolari per registrazioni elettrofisiologiche e smaltirli in una piastra di polipropilene a fondo piatto a 96 pozzetti. Per eseguire la registrazione con pinza di tensione a due elettrodi, posizionare una piastra contenente gli ovociti sul sistema automatizzato.Programmare il sistema di registrazione automatizzato utilizzando l'interfaccia basata su icone con questo schema per la determinazione appropriata della relazione tra attività di concentrazione. Per l'adattamento della curva, utilizzando la curva di attivazione della concentrazione illustrata, tracciare l'ampiezza corrente in funzione del logaritmo della concentrazione dell'agonista. Per la registrazione elettrofisiologica, mantenere il cervello in una soluzione di dACSF gorgogliata con carbogeno a temperatura ambiente.Quindi, sezionare la formazione ippocampale sinistra con una spatola fine. Successivamente, sezionare dei vetrini trasversali di 400 micrometri di spessore dalla parte mediana dell'ippocampo con un tritatessuto. Utilizzando un pennello, trasferire le fette nella camera di registrazione e mantenerle a temperatura ambiente per 45 minuti.Successivamente, perfondere le fette con rACSF gorgogliato con carbogeno a 35 gradi Celsius e a una velocità di 1,5 millilitri al minuto. Per registrare un singolo picco di popolazione, posizionare una fetta di cervello nella camera montata sul microscopio. Perfondere la fetta con rACSF alla velocità di tre millilitri al minuto.Utilizzando l'estrattore per pipette, estrarre una micropipetta in vetro borosilicato con una resistenza di circa due megaohm. Riempire la micropipetta con una soluzione contenente due molari di cloruro di sodio e inserirla nel supporto della pipetta. Posizionare la micropipetta di registrazione nello strato piramidale nella regione CA1 della fetta ippocampale utilizzando il micromanipolatore destro.Successivamente, posizionare un elettrodo bipolare di platino iridio isolato nel supporto sul micromanipolatore sinistro. Posizionare l'elettrodo di stimolazione nei collaterali di Schaffer nella regione CA1 della fetta ippocampale utilizzando il micromanipolatore sinistro. Utilizzando il generatore di stimolo, erogare un impulso di corrente all'elettrodo di stimolazione ogni 30 secondi e aumentare gradualmente la forza di stimolazione fino a quando non appare un picco di popolazione.Regola l'intensità dello stimolo per evocare un picco di popolazione corrispondente al 45% dell'ampiezza massima che può essere ottenuta. Per eseguire l'inibizione dell'impulso accoppiato, erogare due impulsi di corrente all'elettrodo di stimolazione ogni 30 secondi utilizzando il generatore di stimolo. Imposta l'intensità dello stimolo in modo che evochi un picco di popolazione corrispondente al 45% dell'ampiezza massima.Per testare i composti, effettuare diluizioni dei composti da testare in ACSF in modo che la concentrazione finale di DMSO non sia superiore allo 0,1%Aggiungere DMSO alla soluzione di controllo alla stessa concentrazione di quella nella soluzione composta. Registrare un picco di popolazione di polso singolo o accoppiato evocato dalle stimolazioni collaterali di Schaffer ogni 30 secondi per almeno 30 minuti. La forma del picco della popolazione dovrebbe essere stabile durante questo periodo di riferimento.Successivamente, preparare un becher con rACSF carbogenato contenente una concentrazione fissa del composto da testare e perfondere la fetta ippocampale con la soluzione durante la registrazione di picchi di popolazione di polso singolo o appaiato. Inoltre, valutare il recupero dall'effetto composto perfondendo la fetta con rACSF carbogenato senza il composto. Qui è mostrata una rappresentazione schematica di una fetta di ippocampo di ratto, i collaterali di Schaffer originati dagli assoni delle cellule piramidali CA3 che si proiettano sull'arborizzazione dendritica dei neuroni piramidali CA1.Le micropipette sono state posizionate nello strato piramidale per registrare i picchi di popolazione e nello strato radiato per le registrazioni dendritiche dei potenziali postsinaptici eccitatori di campo. L'elettrodo di stimolazione è stato posizionato all'interno dei collaterali di Schaffer. Questa figura mostra i picchi di popolazione evocati dagli stimoli accoppiati applicati attraverso lo stesso elettrodo stimolante a un intervallo di 20 millisecondi.La risposta della popolazione al secondo stimolo è di ampiezza inferiore a quella della risposta al primo stimolo. Picchi di popolazione sono stati registrati in assenza e presenza di beta CCM, un recettore GABA A non selettivo NAM. Beta CCM ha aumentato l'ampiezza del secondo picco di popolazione bloccando parzialmente qualsiasi inibizione gabaergica feed-forward.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la farmacocinetica, l'occupazione e l'efficacia dei recettori in vivo e la farmacologia della sicurezza, al fine di rispondere a ulteriori domande, come il potenziale di sviluppo clinico dei composti identificati.

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In questo articolo, si descrive un metodo utile per lo studio ligando funzione di canale ionico in neuroni di fettine di cervello acuto isolato. Questo metodo comporta l'uso di un farmaco-riempita micropipetta per applicazione locale di farmaci per neuroni registrati utilizzando tecniche standard di patch clamp.

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Qui mostriamo l'uso di colorante fluorescente Alexa accoppiato ad α-bungarotossina per misurare GABA A localizzazione superficiale recettore e endocitosi nei neuroni dell'ippocampo. Attraverso l'uso di costrutti recanti un breve tag extracellulare che lega α-bungarotossina, analisi di proteine ​​di membrana plasmatica traffico endocitico può essere raggiunto.

L&#39;utilizzo di un α-bungarotossina Binding Tag sito per studiare GABA un recettore di membrana localizzazione e il traffico

I meccanismi molecolari che coordinare la formazione di sinapsi inibitorie GABAergici durante l'ontogenesi sono in gran parte sconosciuti. Per studiare questi processi, abbiamo sviluppato un sistema di co-coltura modello che incorpora embrionali i neuroni GABAergici di medie spinosa coltivate insieme stabilmente trasfettate rene embrionale umano 293 (HEK293), le cellule che esprimono i recettori GABA A funzionali.

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L'obiettivo del presente protocollo è quello di facilitare lo studio dei recettori NMDA (NMDAR) a scala più ampia e consentire l'esame degli effetti modulatory di piccole molecole e le loro applicazioni terapeutiche.

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Questo metodo introduce una semplice tecnica per il rilevamento del rilascio endogeno di monoammina utilizzando fette di cervello acute. La configurazione utilizza una piastra a 48 pozzetti contenente un supporto in tessuto per il rilascio di monoammina. La monoammina rilasciata viene analizzata mediante HPLC accoppiato con il rilevamento elettrochimico. Inoltre, questa tecnica fornisce un metodo di screening per la scoperta di farmaci.

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