Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul metabolismo cerebrale della Drosophila e su come l'eccessiva proliferazione delle cellule gliali influenzi la riprogrammazione metabolica, indipendentemente dal fatto che la dieta o il comportamento alterino il metabolismo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i cervelli dei moscerini possono essere analizzati metabolicamente come un intero tessuto intatto con risultati riproducibili ottenuti dalla misurazione di un solo cervello alla volta. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul metabolismo del cervello del moscerino, può essere applicato anche ad altri tessuti e sistemi modello come i dischi immaginali e C.elegans, rispettivamente.

Per preparare le cinture dei microtessuti, dal contenitore di conservazione selezionare una restrizione dei microtessuti per cervello che viene misurata, più almeno tre da utilizzare come controlli di sola contenzione. Utilizzando un cestello a rete e una piastra a sei pozzetti, sciacquare i sistemi di ritenuta con etanolo al settanta percento e lavarli con acqua deionizzata tre volte, ogni volta per due minuti. Eseguire ulteriori lavaggi con acqua se le cinture emanano ancora odore di alcol.

Lavare i sistemi di ritenuta dei microtessuti nei terreni di analisi e lasciarli nella soluzione fino a quando non sono pronti per l'uso. Per sezionare il cervello larvale di Drosophila melanogaster, selezionare le larve del tardo terzo stadio da una fiala di mosche dell'organo R in coltura. Posizionare la larva nel pozzetto di una piastra di dissezione pulita contenente 500 microlitri di 1x PBS.

Successivamente, lavate la larva agitandola delicatamente nel pozzetto e trasferitela in un altro pozzo pulito. Quindi, posizionare la piastra spot sotto il microscopio da dissezione. Afferra la larva al centro con un paio di pinzette mentre afferra i ganci degli occhi con un secondo paio di pinzette.

Tirare delicatamente e dolcemente la larva in direzioni opposte usando le due serie di pinzette. Visualizza il cervello che in genere rimane attaccato ai ganci oculari e comunemente ha dischi antennali oculari attaccati ad esso. Usando i ganci per gli occhi per tenere il cervello in posizione, rimuovere con cura i tessuti aggiuntivi.

Infine, separa i ganci oculari dal cervello. Quindi, usa una pinzetta per trasferire il cervello sezionato in un nuovo pozzetto contenente 1x PBS. Per aggiungere i cervelli sezionati a una piastra di saggio metabolica a 96 pozzetti, aggiungere prima 50 microlitri di terreno di prova a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti sperimentali, di controllo, di sola contenzione e di fondo.

Quindi, posiziona con cura un cervello in ogni pozzetto. Sotto il microscopio di dissezione, utilizzare una microsonda ad ago piegato per premere il cervello sul fondo del pozzetto. Posiziona delicatamente il cervello al centro delle tre sfere sollevate usando la sonda.

Per aggiungere un sistema di ritenuta dei microtessuti alla piastra del saggio metabolico a 96 pozzetti, posizionarla prima sul bordo. Al microscopio, orientalo con l'anello di plastica rivolto verso il basso e la rete in alto. Quindi, rimuovere la piastra dal microscopio.

Usa le pinzette per afferrare il sistema di ritenuta su entrambi i lati e lascialo cadere delicatamente nel pozzo. Utilizzare una microsonda ad ago piegato per premere il sistema di ritenuta nel pozzetto. I sistemi di ritenuta dei microtessuti devono essere posizionati correttamente sopra il cervello centrato in ciascun pozzetto affinché questa tecnica fornisca risultati significativi.

Al microscopio, verificare che il cervello sezionato possa essere visto attraverso il sistema di ritenuta tissutale e che sia centrato nel pozzetto e ripetere la procedura per tutti i pozzetti che verranno utilizzati nel saggio. Aggiungere con cautela 130 microlitri di terreno di prova a ciascuno dei pozzetti sperimentali, di controllo e di sola contenimento. Verificare che il cervello e i sistemi di ritenuta dei microtessuti non si siano mossi durante l'aggiunta del terreno.

Quindi, aggiungere 180 micro-litri di terreno di analisi ai quattro pozzetti d'angolo per utilizzarli come controllo di fondo. In questa procedura, rimuovere la piastra di utilità e aggiungere la piastra cellulare senza il coperchio con lo stesso orientamento all'analizzatore metabolico. Selezionare la piastra della cella di carico" per consentire allo strumento di assorbire la piastra della cella e chiudere il vassoio e quindi iniziare il saggio.

Al termine del test, rimuovere la piastra cellulare espulsa e la cartuccia. Utilizzando un microscopio da dissezione, verificare che il cervello e i sistemi di ritenuta dei microtessuti siano ancora posizionati correttamente nel pozzetto dopo il completamento del test ed escludere dall'analisi eventuali pozzetti con anomalie. Quando vengono seguite le condizioni ottimizzate, i test con il cervello larvale e adulto portano a letture di OCR leggermente superiori a 150 picomoli al minuto al sesto punto temporale stabilizzato, a circa 25 minuti dall'inizio del test.

Questa velocità viene mantenuta per almeno 30 minuti e fino a due ore. L'ECAR è leggermente inferiore nel cervello adulto rispetto al cervello larvale al sesto punto temporale e viene mantenuto per almeno 30 minuti. Questo risultato corrisponde ad un aumento della glicolisi durante gli stadi larvali per sostenere la crescita.

Un'iniezione con un inibitore mitocondriale, come l'oligomicina, abbassa le letture dell'OCR per rivelare la respirazione ATP-dipendente e un ulteriore trattamento con rotenone e antimicina A abbassa l'OCR per rivelare il consumo di ossigeno non mitocondriale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di centrare il cervello e assicurarsi che il sistema di ritenuta dei microtessuti sia fissato in posizione prima di eseguire il test e durante l'analisi. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la PCR quantitativa e l'analisi western blot per rispondere a ulteriori domande su come l'espressione genica contribuisca al fenotipo metabolico osservato.