Inquirenti rigenerazione dell'assone dei mammiferi: In Vivo elettroporazione del ganglio di radice dorsale del topo adulto

L'elettroporazione è un approccio efficace per trasportare geni degli interessi nelle cellule. Applicando questo approccio in vivo sui neuroni del ganglio di topo adulto radice dorsale (DRG), descriviamo un modello per lo studio di rigenerazione dell'assone in vivo.

Questo metodo fornisce una tecnica di trasfezione genica in vivo per manipolare l'espressione genica nei neuroni sensoriali di topo adulto per futuri studi sull'eso-rigenerazione dei mammiferi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede meno lavoro e tempo e può sovraesprimere e abbattere i geni bersaglio contemporaneamente e separatamente. Per iniziare questa procedura, segnare entrambi i lati della cresta iliaca di un topo anestetizzato con un pennarello sottile.

Tracciare una linea che colleghi due punti della cresta iliaca per facilitare l'identificazione delle posizioni dei DRG L5. Quindi, praticare un'incisione di tre centimetri lungo la linea mediana della parte bassa della schiena con micro forbici. Successivamente, staccare i muscoli paraspinosi, come il musculus multifidus e il musculus longissimus lumborum, dai processi spinosi L3 a S1 ed esporre l'articolazione fasciale di L4-5 e L5-6.

Successivamente, utilizzare un micro rongeur per rimuovere le articolazioni della fascia L4-5 e L5-6. Successivamente, rimuovere l'arco neurale sinistro di L4 e L5, per esporre il lato dorsale dei DRG. Per l'iniezione di DRG, caricare i plasmidi di DNA o gli oligo di RNA nella pipetta capillare di vetro.

Quindi, inserire con cautela la punta della pipetta capillare di vetro nel DRG e iniettare gradualmente una soluzione di microlitro di plasmidi di DNA o oligo di RNA utilizzando il sistema di dispensazione per microiniezione intracellulare. Per l'elettroporazione, pizzicare delicatamente il DRG target con gli elettrodi e applicare cinque impulsi elettrici quadrati con il sistema di elettroporazione. Successivamente, chiudere il muscolo, quindi gli strati cutanei con punti di sutura in nylon.

Due o tre giorni dopo l'elettroporazione DRG, anestetizzare il topo per via intraperitoneale, fissare gli arti con del nastro adesivo sulla tavola di sughero e praticare un'incisione di un centimetro a 0,5 centimetri sul lato sinistro lungo la linea mediana. Quindi, taglia longitudinalmente i muscoli, come il muscolo grande gluteo e il muscolo piriforme. Quindi, esporre il segmento del nervo sciatico tra il grande forame sciatico e la tacca sciatica.

Schiacciare il nervo con una pinza per microchirurgia per 12 secondi e contrassegnare il sito di schiacciamento con una sutura epineurale in nylon. Successivamente, chiudere gli strati muscolari e cutanei con una sutura di nylon. Dopo la profusione, separare i DRG insieme alle radici nervose e al nervo sciatico, con attenzione, con micro forbici e micro pinze al microscopio da dissezione.

Quindi, trasferire il nervo sciatico direttamente in PFA al 4% durante la notte a quattro gradi Celsius. Per visualizzare e misurare gli assoni sensoriali marcati con fluorescenza al microscopio di dissezione, rimuovere il tessuto attaccato e la membrana sul nervo sciatico fisso con micro forbici e micro pinze, con attenzione. Quindi, lavare il nervo con PVS tre volte.

Quindi, posiziona il nervo sciatico su un vetrino e tienilo dritto. Aggiungere 80 microlitri di soluzione anti-sbiadimento attorno al nervo, quindi stendere un vetrino coprioggetti su di esso. Appiattire l'intero tessuto montato con la pressione.

Successivamente, posizionare il tessuto appiattito sotto il microscopio a epifluorescenza invertita, dotato di un accessorio per l'acquisizione del mosaico e l'elaborazione delle immagini. Quando si misura la lunghezza degli assoni rigenerati, tracciare tutti gli assoni identificabili marcati in fluorescenza nel nervo sciatico dal sito di schiacciamento alle estremità degli assoni distali. Quando si applica l'attuale metodo di elettroporazione in vivo per studiare la rigenerazione assonale, il nervo sciatico è stato appiattito e visualizzato.

Ogni assone rigenerato con traiettoria distintiva e estremità dell'assone distale riconoscibile, può essere rintracciato dal sito di schiacciamento indicato dal nodo di sutura. La punta della freccia bianca, la freccia e la stella indicano tre estremità distintive degli assoni, che si estendono tutte dal sito di schiacciamento. Inoltre, i DRG sono stati elettroporati con plasmidi EGFP e il midollo spinale è stato raccolto.

Gli assoni della colonna dorsale marcati con EGFP, nel midollo spinale, sono stati ripresi e identificati sia nell'immagine di proiezione longitudinale che in quella sagittale. Ecco una vista dettagliata degli assoni nella colonna dorsale e qui c'è una vista dettagliata degli assoni nella zona di ingresso della radice dorsale. Questa immagine mostra la proiezione sagittale degli assoni marcati con EGFP all'interno della colonna dorsale.

In alternativa, le immagini confocali possono essere elaborate con un software di visualizzazione al microscopio per ricostruire un'immagine 3D. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di posizionare correttamente i DRG L4 e L5 e di fare un nodo sulla membrana durale senza impalare, mentre si etichetta il sito di schiacciamento con un nodo di sutura. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della rigenerazione degli assoni per esplorare i geni necessari per la PNS, la rigenerazione naturale degli assoni o i geni che possono promuovere ulteriormente la rigenerazione nel topo adulto in vivo.