In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Presentiamo un in vivo imaging protocol per la corteccia cerebrale di topi neonatali di imaging due fotoni. Questo metodo è adatto per analizzare la dinamica dello sviluppo dei neuroni corticali, i meccanismi molecolari che controllano le dinamiche neuronali e i cambiamenti nella dinamica neuronale in modelli di malattia.

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nelle neuroscienze, in particolare quelle relative alla formazione della presa neuronale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i ricercatori possono analizzare i cambiamenti morfologici dei singoli neuroni nei topi neonatali viventi. Inizia con un cucciolo anestetizzato del quinto giorno post-natale e procedi solo in assenza di una reazione al test di avvicinamento delle dita della coda.

In primo luogo, sterilizzare il cuoio capelluto pulerlo con il 70% di etanolo. Quindi, utilizzare forbici sterilizzate con 70%etanolo per rimuovere circa 20 millimetri quadrati della pelle che copre il cranio. Successivamente, utilizzare forcep sterili e un batuffolo di cotone pulito imbevuto di tampone di corteccia, per rimuovere la fascia del cranio.

Utilizzare una punta di carico per applicare l'adesivo tissutale sulla superficie della pelle incisa per fermare il sanguinamento evitando l'immagine dell'area. Posizionare il cucciolo su un altro pad riscaldante, impostato su 37 gradi Celsius, e consentirgli di riprendersi dall'anestesia. Attendere circa 30 minuti fino a quando l'adesivo tissutale non si è asciugato e solidificato.

Una volta che l'adesivo tissutale si è asciugato, inizia la preparazione della finestra cranale sul topo riaestetizzato. Applicare una goccia di tampone di corteccia sul cranio, quindi utilizzare una lama di rasoio sterile per aprire con cura un'area di diametro di un millimetro del cranio, lasciando intatta la dura. Applicare il tampone della corteccia per mantenere la superficie cerebrale umida.

Utilizzare un piccolo pezzo di spugna di gelatina imbevuta di tampone di corteccia per fermare qualsiasi sanguinamento. Utilizzare un pezzo fresco per comprimere un lato della craniotomia e drenare qualsiasi tampone e sangue dalla superficie dura senza toccare la dura. Questo è il passaggio più critico per preparare una finestra chiara.

La dura deve essere intatta e il pennello deve essere rimosso dalla dura esposta. Quindi, utilizzare una punta di pipetta per applicare uno strato sottile di agarosio a bassa fusione dell'uno per cento, sciolto nel tampone della corteccia. Applicare una copertura rotonda in vetro di tre millimetri sullo strato di gel di agarosio.

Rimuovere tutte le bolle tra lo scivolo di copertura e lo strato di gel di agarosio versando in eccesso il gel di agarosio tra di loro. Utilizzare le pinzette per rimuovere il gel in eccesso, sporgendo da sotto lo scivolo di copertura. Mescolare la polvere di cemento e il liquido cementicolo.

Utilizzare una punta di pipetta per applicare la miscela sul cranio prima che si solidifica. Quindi, attaccare una barra di titanio su misura all'osso cranicio usando cemento dentale. Allineare la barra in titanio e il coperchio scivolare in parallelo per acquisire facilmente le immagini.

Coprire il cranio esposto con cemento dentale. Quindi, iniettare per via sottocutanea un analgesico. Mettere il cucciolo in una gabbia di recupero su un dissipatore di calore di 37 gradi Celsius per un'ora fino a quando il cemento dentale non si è solidificato.

Per iniziare l'imaging, impostare prima la lunghezza d'onda del laser a due fotoni. Per l'eccitazione RFP, utilizzare una lunghezza d'onda di 1000 nanometri. Pulire la superficie del coperchio scivolare con il 70% di etanolo.

Attaccare il cucciolo anestetizzato alla piastra di titanio sullo stadio di imaging, utilizzando la barra di titanio. Utilizzare lo stadio del goniometro, per regolare la testa, in modo che lo slittamento del coperchio sia parallelo all'obiettivo. Mantenere la temperatura corporea del cucciolo durante l'imaging utilizzando una pastiglia di riscaldamento impostata su 37 gradi Celsius e ridurre la concentrazione di isoflurane allo 0,7%-1%Posizionare la fase di imaging sotto la lente obiettivo 20x del microscopio a due fotoni.

Applicare una goccia d'acqua sullo scivolo di copertura. Impostare il software per acquisire immagini Z-stack a intervalli di 1,4 micron. Per l'imaging neuronale di quarto livello, impostare la larghezza Z tra 150 e 300 micron per l'immagine dell'intera morfologia dendritica.

Usa la scansione lenta e la media per ottenere immagini chiare che mostrano la morfologia neuronale. Di solito ci vogliono più di 20 minuti per acquisire l'intera morfologia dendritica. Questa immagine mostra un'immagine rappresentativa z-stack dei quattro neuroni corticali di livello quattro del cucciolo P5.

La freccia indica il neurone da analizzare. I neuroni con dendriti sfocati devono essere rimossi dall'analisi. Questa immagine mostra un'immagine di ingrandimento più elevata del neurone indicato nell'immagine precedente.

Le punte delle frecce blu indicano punte dendritiche che verranno ritirate al momento successivo, e le piccole punte di freccia bianche indicano l'assone di una cella vicina. Dopo 4,5 ore, le punte dendritiche con punte di freccia blu vengono retratti e le punte dendritiche con punte di freccia gialle sono allungate. Qui viene mostrata una ricostruzione rappresentativa della morfologia dendritica, i neuroni che mostrano dendriti disconnessi come visto qui, dovrebbero essere esclusi dalle analisi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere intatta la dura, durante il processo. Utilizzando questa procedura, altri metodi come nell'imaging di propulsione possono essere eseguiti per rispondere ad altre domande relative al modello di attività neuronale nel cervello neonatale.