Name: Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Scopri modelli di lesione in zebrafish adulti per studiare gli effetti del prednisolone sulla rigenerazione ossea. Questo metodo combina esposizione sistemica al farmaco con tecniche di imaging per analizzare la mineralizzazione e i processi di guarigione.

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Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del centro di rigenerativa terapie Dresda ("Zebrafish come modello di svelare i meccanismi di perdita dell'osso indotta da glucocorticoidi") e inoltre da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, progetto 387653785) a FK. Siamo molto grati a Jan Kaslin e Avinash Chekuru per il loro orientamento e assistenza su come eseguire la trapanazione dei calvariae e fratture in raggi della pinna ossuta. Esperimenti sono stati progettati, eseguiti e analizzati da KG e FK. FK ha scritto il manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Katrin Lambert, Nicole Cudak e gli altri membri dei laboratori Knopf e marca per assistenza tecnica e la discussione. Il nostro grazie va anche a Marika Fischer e Jitka Michling per la cura del pesce eccellente e di Henriette Knopf e Josh Currie di correzione il manoscritto per.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal Landesdirektion di Dresda (permesso di numeri: AZ D 24-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. preparazione dei materiali e delle soluzioni
Nota: Prednisolone, come altri glucocorticoidi, conduce all'immunosoppressione. Così, precauzione deve essere presa per prevenire l'infezione negli animali trattati durante l'esperimento. A tal fine, articoli di vetro di autoclave e 'acqua di pesce' (cioè, l'acqua che viene utilizzata per posteriore zebrafish adulto) prima di iniziare l'esperimento.
<ol><li>Calcolare il numero di zebrafish per essere utilizzato nell'esperimento. Assicurarsi di includere gli individui che fungono da controlli.</li>
	<li>Coppe di vetro autoclave 600 mL che sono coperti con foglio di alluminio con nastro autoclave. Zebrafish sarà trattato singolarmente, quindi 1 bicchiere è richiesto per zebrafish.</li>
	<li>Calcolare la quantità di pesci di acqua necessaria per l'esperimento. 300 mL sono richiesti per persona al giorno. Prendere in considerazione la durata dell'esperimento (ad es., 1 settimana/7 giorni).</li>
	<li>Riempire le bottiglie di vetro con pesci d'acqua, chiudere loro ed autoclave le bottiglie con nastro autoclave. Idealmente, usare bottiglie da 2 litri, ma altre bottiglie come L 1 o 5 L possono essere usate pure. Nota: Se gli esperimenti sono lunghi (ad es., 4 settimane/28 giorni) e la quantità di bottiglie di vetro è limitata, assicurarsi di preparare bottiglie per un minimo di parecchi giorni alla volta e ripetere il processo (1.3-1.4) in tutto l'esperimento.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di prednisolone di prednisolone sterile filtrata 100 mM in dimetilsulfossido (DMSO). Congelare il brodo in 1 mL o aliquote di tubo del microcentrifuge 2 mL. Attenzione: Sempre indossare indumenti di protezione quando lavorano con il prednisolone (guanti, occhiali protettivi, camice da laboratorio).</li>
	<li>Il primo giorno dell'esperimento, preparare soluzioni di incubazione con il prednisolone e DMSO, rispettivamente. A tal fine, scongelare la quantità necessaria di soluzione stock di prednisolone 100 mM e aggiungere prednisolone pesce in autoclave acqua ad una concentrazione finale di 50 µM.<ol>
<li>Per i trattamenti di controllo, aggiungere il volume corrispondente di DMSO per acqua pesci in autoclave. Ad esempio, per produrre acqua di 2L prednisolone contenenti pesci, aggiungere 1 mL di brodo di prednisolone 100 mM a 2 L di acqua di pesce. In un'altra bottiglia di 2 L di acqua di pesce, aggiungere 1 mL di DMSO, corrispondentemente.</li>
		<li>Lavorare in un luogo appropriato designato per eseguire trattamenti farmacologici, idealmente in una stanza a 27 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. generazione delle lesioni in Zebrafish pinne
Nota: Per ferire osso in zebrafish pinne, effettuare la resezione della pinna (amputazione, solitamente nella pinna caudale) o frattura raggi della pinna ossuta individuali (modello di frattura). A tal fine anestetizzare zebrafish adulto prima.
<ol><li>Amputazione<ol>
<li>Per anestetizzare zebrafish adulto, preparare un diametro di 100 mm di Petri contenente 0,02% MS-222 (etil-3-aminobenzoato methanesulfonate) in acqua di pesci (quest'acqua non deve necessariamente essere sterilizzato nell'autoclave).<ol>
<li>Trasferire uno zebrafish alla volta di Petri contenente MS-222 utilizzando una rete dei pesci e incubare finché giace su un fianco senza movimento e non risponde al tocco. Prova a quest'ultimo toccando la pinna anale con il forcipe smussato.</li>
			<li>Attendere finché non viene raggiunto il livello 4 di anestesia che è il livello appropriato per pinna resezione12. In questa fase, il tasso di movimento opercular è diminuito, tono muscolare viene perso e il pesce non si muove su touch12.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prendere forcipe smussato e trasferimento zebrafish anestetizzati con attenzione al coperchio inversed di 100mm di Petri. Mettere il pesce zebra sul lato laterale. Assicurarsi che il pesce zebra mentono sempre lo stesso orientamento, ad esempio sul loro lato destro del corpo. Con un bisturi o una lametta, resecare il 50% della pinna (Figura 1A, 2A). Nota: La velocità di rigenerazione di zebrafish pinna dipende dalla quantità di tessuto resecato pinna, vale a dire, l'altro tessuto di pinna è resecato, il più veloce la pinna Rigenera13. Così, per ridurre al minimo variazioni nella rigenerazione di pinna assicurarsi sempre resecare la pinna allo stesso livello in tutti i zebrafish.</li>
		<li>Trasferimento zebrafish feriti a un bicchiere di vetro sterilizzati nell'autoclave contenente mL 300 di prednisolone o DMSO contenente acqua pesci in autoclave. Coprire il becher di vetro con carta stagnola per evitare la fuga di zebrafish.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.1.2 a 2.1.3 è raggiunto il numero richiesto di zebrafish per l'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frattura di pinna<ol>
<li>Preparare un 100mm rivestite su agarosio di Petri riscaldando una soluzione di agarosio 2% in acqua di pesci o E3 (media embrione 3, 50 mM di cloruro di sodio, cloruro di potassio 0,17 mM, 0,33 mM di cloruro di calcio, solfato di magnesio di 0,33 mM). Attentamente, versare circa 10 – 15 mL della soluzione di Petri. Il fondo del piatto dovrebbe essere completamente coperta. Lasciate che l'agarosio solidificare.</li>
		<li>Anestetizzare zebrafish come descritto nella sezione 2.1.</li>
		<li>Prendere il forcipe smussato e trasferimento zebrafish anestetizzati con attenzione per il 100mm rivestite su agarosio di Petri. Mettere il pesce zebra sul lato laterale. Sotto il microscopio di dissezione, diffondere la pinna caudale completamente per essere in grado di identificare i raggi della pinna ossuta distinti e pinna segmenti di ray. Assicurarsi che il pesce zebra mentono sempre lo stesso orientamento, ad esempio sul loro lato destro del corpo.</li>
		<li>Con un ago per iniezione (0,3 mm x 13 mm) introdurre una frattura al centro di un segmento di ray ossuta pinna (Figura 1B). Per effettuare questa operazione, l'ago viene inserito leggermente il segmento fino a quando appare una crepa (freccia in Figura 2B). Mentre leggera pressione conduce alla frattura di uno solo dei due hemirays avversaria più forte pressione porterà alla frattura di entrambi i segmenti hemiray.<ol>
<li>Non introdurre troppi fratture nelle pinne, poiché questo comprometterà notevolmente la stabilità della pinna. Come suggerimento, si applicano le fratture solo in 3 a 5 raggi della pinna.</li>
			<li>Sempre produrre fratture in segmenti corrispondenti tra raggi della pinna differenti e zebrafish, per esempio in raggi della pinna dorsale 3, 7 (o 8) e pinna ventrale ray 3. Il livello prossimale-distale della frattura è ideale a 3 segmenti prossimali biforcazione punto 11 dei raggi della pinna.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Trasferimento zebrafish feriti a un bicchiere di vetro sterilizzati nell'autoclave contenente mL 300 di prednisolone o DMSO contenente acqua pesci in autoclave. Coprire il becher di vetro con carta stagnola per evitare la fuga di zebrafish.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.2.2 a 2.2.5 è raggiunto il numero richiesto di zebrafish per l'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. generazione di lesioni Calvarial del cranio (Trepanation)
Nota: Il calvariae in zebrafish sono omologhi ai ossa calvarial nei mammiferi. Così, queste ossa esoscheletrica14 rappresentano un tessuto di particolare interesse nello studio della patogenesi di GIO. Per ferire il cranio, trapanazione viene eseguita da un foro frontale Os e/o Os parietale (Figura 1, 2C) con l'aiuto di un microdrill11.
<ol><li>Anestetizzare zebrafish conformemente al punto 2.1.</li>
	<li>Tenere il zebrafish anestetizzati in posizione verticale con il forcipe, cosicché le ossa calvarial sono ben visibili sotto un microscopio di dissezione dall'alto (Figura 1).</li>
	<li>Individuare il microdrill rotante al centro dell'osso frontale (Os frontale) e toccare l'osso. Il foro prodotto è della dimensione microdrill Burr (500 µm, Figura 2, Figura 3B). Nota: Assicurarsi di non spostare il microdrill lateralmente, producendo le lesioni. Inoltre arresta immediatamente quando scende improvvisamente la resistenza dell'osso. Non praticare qualsiasi ulteriormente, altrimenti il cervello sarà danneggiato 15.</li>
	<li>Trasferimento zebrafish feriti in una gabbia riempita con acqua di pesce fino a quando si recupera completamente dall'anestesia. Guardate attentamente.</li>
	<li>Trasferire l'infortunato zebrafish per un pesce di acqua plus prednisolone o bicchiere di vetro contenente DMSO.</li>
</ol>4. trattamento di Zebrafish durante l'incubazione
Nota: Durante l'applicazione di prednisolone/DMSO, il farmaco contenente acqua di pesce deve essere cambiata ogni giorno, e zebrafish devono essere alimentati regolarmente.
<ol><li>Cambi d'acqua<ol>
<li>Per scambiare l'acqua di pesce, scongelare stock prednisolone 100 mM e preparare la quantità necessaria di prednisolone µM 50 nei pesci in autoclave acqua dolce ogni giorno del periodo di trattamento. Preparare il DMSO contenente acqua di pesce per il controllo di zebrafish di conseguenza.</li>
		<li>Prendere un bicchiere di vetro contenente un singolo zebrafish alloggiata nella sua soluzione di incubazione e trasferire la soluzione tra cui zebrafish in un apposito contenitore, ad esempio una gabbia di alloggiamento temporale. Nota: Sempre uso contenitori intermedi separati per prednisolone e DMSO trattata zebrafish, rispettivamente, per assicurarsi DMSO controllo zebrafish non vengono esposti al prednisolone e viceversa.</li>
		<li>Riempire il bicchiere di vetro con fresco farmaco contenente pesce acqua (300 mL).</li>
		<li>Consente di trasferire il bicchiere di vetro contenente soluzione di incubazione fresco utilizzando un netto di pesce zebrafish dal contenitore intermedio. Rimettere la pellicola per evitare la fuga di zebrafish.</li>
		<li>Se il tempo dell'esperimento supera 2 settimane, scambiare i bicchieri di vetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alimentazione<ol>
<li>Durante i trattamenti brevi (per fino a 2 giorni) non si nutrono di zebrafish. Durante gli esperimenti più a lungo, alimentazione zebrafish. Prestare particolare attenzione per evitare l'inquinamento della soluzione incubazione. Così, alimentare con Artemia SSP. , piuttosto che con mangime in fiocchi e solo su ogni secondo giorno. Nota: Artemia vengono regolarmente utilizzati per nutrire il giovane zebrafish e dovrebbe essere disponibile nell'unità inamidata zebrafish.<ol>
<li>Circa 2 h prima di acqua i pesci vengono scambiati, mangimi zebrafish con Artemia ssp in loro bicchieri di vetro. A tale scopo, utilizzare una pipetta di plastica e avanzamento 0,5-1 mL di soluzione di Artemia tratteggiato per bicchiere di vetro.</li>
			<li>Attendere per 2 h e scambiare la soluzione di incubazione con fresco farmaco contenente acqua di pesce secondo il paragrafo 4.1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. analisi dei campioni
Nota: Dopo l'incubazione di zebrafish feriti in prednisolone e DMSO contenente acqua di pesce, rispettivamente, eseguire analisi di mineralizzazione/calcificazione dell'osso (5.1 a 5.3) o effettuare live imaging di zebrafish sotto il microscopio di dissezione (5.4) 10,11,16. Utilizzare live imaging per determinare lunghezza rigenera pinna e per rilevare le differenze nell'espressione del gene reporter in zebrafish transgenici.
<ol><li>
Fissazione dei tessuti di interesse
	<ol>
<li>Per il fissaggio delle pinne e/o teschi preparare paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS e congelare a-20 ° C per la conservazione. Uso preparata il 4% PFA in PBS o disgelo la quantità necessaria prima dell'uso. In alternativa, il 2% può essere utilizzato PFA in PBS. Attenzione: PFA è tossica e dovrebbe essere maneggiato con cura sotto cappa aspirante. Indossare indumenti protettivi.</li>
		<li>Per il fissaggio delle pinne preparare un piccolo piatto di Petri (ad es. 30 mm) con freddo 4% PFA in PBS e assicurarsi che il fondo del piatto è completamente coperto. Per il fissaggio di teschi, preparare un piccolo vaso di vetro con coperchio o un tubo con freddo 4% PFA in PBS. Attenzione: Maniglia PFA contenenti soluzioni soltanto sotto la cappa come è tossico. Indossare indumenti protettivi.</li>
		<li>Raccogliere il tessuto di interesse.<ol>
<li>Per la raccolta di rigenerazione tessuto pinna o pinne con fratture anestetizzare zebrafish conformemente al punto 2.1 o eutanasia zebrafish conformemente al punto 5.1.5.</li>
			<li>Trasferire il zebrafish anestetizzati al coperchio di una scatola di Petri. Usando un bisturi o lametta, raccogliere la pinna si rigenerano. Assicurati di includere il ceppo del tessuto nella rigenerazione di pinne per facilitare la movimentazione del tessuto raccolto.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Difficoltà pinne Appartamento in PFA contenente di Petri a 4 ° C durante la notte. Fissazione del piatta evita di curling del tessuto pinna durante la fissazione.<ol>
<li>Per risolvere il piatto, afferrare il tessuto pinna con un forcipe fine al bordo dorsale o ventrale del moncone e immergerlo nella soluzione di fissaggio. Afferrare il bordo opposto del ceppo con un forcipe fine secondo e premere leggermente il tessuto sul fondo del piatto.</li>
			<li>Tenere premuto per 10-20 s prima del rilascio. Il tessuto di pinna non dovrebbe rannicchiarsi piu '. Se lo fa, ripetere.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eutanasia zebrafish al fine di raccogliere feriti cranio tessuto. Preparare un diametro di 100 mm di Petri contenente 0,1% MS-222 in acqua pesci. Trasferire uno zebrafish alla volta per la capsula di Petri contenente MS-222 utilizzando una rete da pesca. Quando viene raggiunto il livello 6 dell'anestesia (compressione midollare) attesa almeno 10 minuti per assicurare la morte dell' esemplare12.</li>
		<li>Usando un bisturi taglia la testa più un piccolo tessuto tronco dal resto del corpo. Immergere il tessuto raccolto nella soluzione preparata 4% PFA nel vaso di vetro o tubo di plastica. Difficoltà per 24 h a 4 ° C con dolce dondolio.</li>
		<li>Per conservare i campioni a lungo termine dopo la fissazione, lavarli con PBS (3 x 20 min a RT) e metanolo-delizia in una crescente serie di metanolo (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 2 x 100% di metanolo in PBS per 20 minuti ciascuno).<ol>
<li>Memorizzarli in metanolo al 100% a-20 ° C. In caso contrario, procedere direttamente con la macchiatura dell'osso o altre analisi dopo il lavaggio con PBS.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tecniche di colorazione dell'osso ho (colore rosso di alizarina che macchia) Nota: Questa colorazione viene eseguita secondo van Eeden et al. 199617 e Walker & Kimmel 200718 con modifiche.<ol>
<li>Per eseguire la colorazione di colore rosso di alizarina su pinne adulti o teschi, raccolto e difficoltà del tessuto come descritto nelle sezioni 5.1.</li>
		<li>Se i campioni sono stati conservati in metanolo a-20 ° C, reidratare campioni facendo una serie di metanolo inversa (70%, 50% e 30% in PBS, ogni 1 x 20 min) e lavare due volte 20 min con PBS. Lavare i campioni per 5 min minimo con acqua deionizzata.</li>
		<li>Per fare colore rosso di alizarina macchiatura in teschi, trattare i campioni con tripsina 50 mg/mL in 30% saturi Na2B4O7 a temperatura ambiente durante la notte. Campioni di roccia durante questo tempo. Campioni di risciacquo in 30% Na2B4O7 soluzione satura. Lavare i campioni con acqua deionizzata 2 volte per 5 minuti ciascuno. Questo passaggio non viene eseguito per tessuto pinna.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di colore rosso di alizarina (parte b: 0,5% colore rosso di alizarina S polvere, 10% glicerolo in acqua deionizzata) e i campioni della roccia durante l'incubazione a RT. Check per la macchiatura dopo 1, 2, 4 h o durante la notte.</li>
		<li>Per cancellare i campioni li trattano con una serie decrescente di idrossido: glicerolo 1% potassio (3:1 pernottamento, 1:1 pernottamento, pernottamento di 1:3).</li>
		<li>Conservare i campioni in una soluzione di 1:1 di idrossido di potassio 0,1%: 80% glicerolo e montarli con 80% glicerolo per l'imaging. Nota: Per combinati Alcian blu/colore rosso di alizarina colorazione trattare campioni con Alcian blu colorazione soluzione (r: parte finale 0,02% Alcian blu, MgCl2, 70% di etanolo) dopo la reidratazione (sezione 5.2.2) per 2 h a RT. Treat pinne con una serie decrescente di etanolo 50 mM MgCl2 (70%, 50%, 30%, ogni 1 x 15 min) e lavare li per un minimo di 1 h (3 x 20 min) in acqua deionizzata. Procedere con il colore rosso di alizarina macchiatura (vedere paragrafo 5.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osso di tecniche di colorazione II (calceina colorazione) Nota: Per rilevare il deposito del calcio nella pinna fratture e lesioni del cranio, pesci vivi sono incubati in calceina contenente soluzione.<ol>
<li>Preparare la quantità necessaria di calceina 0,2% in acqua deionizzata (pH 7.5). Assicurarsi che il pH è neutro. Utilizzare 1 M NaOH per aggiustare il pH.</li>
		<li>Incubare fino a 3 zebrafish contemporaneamente in 100 mL di soluzione di calceina per 20 min in un becher di vetro coperto con carta stagnola.</li>
		<li>Trasferire un becher con acqua di pesce zebrafish. Far loro nuotare brevemente prima di trasferirli in un recipiente di nuovo con acqua di pesce. Lasciarli a nuotare in questo nuovo Becher per 20 min a lavare. Scattare foto (vedere paragrafo 5.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Live imaging di zebrafish
	<ol>
<li>Utilizzare questo approccio per acquisire immagini di rigenerare il tessuto osseo come nella pinna o cranio in tutto l'esperimento senza sacrificare la zebrafish. Anestetizzare zebrafish conformemente al punto 2.1.</li>
		<li>Per acquisire immagini di pinna rigenera, trasferire il zebrafish anestetizzati su un piatto di Petri rivestite con agarosio (cfr. punto 2.2.1 e Figura 1B).</li>
		<li>Per acquisire immagini di rigenerazione delle ossa del cranio, posto in posizione verticale in una spugna (Figura 1) zebrafish o metterlo in un piatto rivestito di agarosio che è stato preparato per tenere il tronco di zebrafish.</li>
		<li>Acquisizione di immagini all'ingrandimento desiderato e ad alta risoluzione utilizzando un programma di installazione di stereomicroscopia.</li>
		<li>Restituire il pesce zebra in un contenitore con fresco o farmaco contenente acqua di pesce.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Zebrafish si sono dimostrati utili nella ricerca scheletrico in molti riguardi. Mutanti selezionati imitano gli aspetti della malattia umana come l'osteogenesi imperfetta o osteoartrite23,24,25,26,27, e le larve, come pure le scale vengono utilizzate per identificare composti anabolizzanti osso piccola molecola schermi7,<sup ...

Zebrafish rappresentano un potente modello animale per studiare la malattia e lo sviluppo dei vertebrati. Questo è dovuto al fatto che essi sono piccoli animali che si riproducono molto bene e che il loro genoma è completamente sequenziato e suscettibili di manipolazione1. Altri vantaggi includono la possibilità di eseguire imaging continuato dal vivo in diverse fasi, compreso formazione immagine in vivo di zebrafish adulto2e la possibilità di eseguire gli schermi della droga a resa elevata in zebrafish larve3. Inoltre, zebrafish possiedono un'elevata capacità rigenerativa in una varietà di organi e tessuti tra cui osso e così servire come un sistema utile per studiare la malattia scheletrica e riparare4,5.
Osteoporosi indotta da glucocorticoidi (GIO) è una malattia che deriva dal trattamento a lungo termine con glucocorticoidi, ad esempio nel corso del trattamento di malattia autoimmune come l'asma o l'artrite reumatoide. GIO si sviluppa in circa il 30% dei pazienti trattati con glucocorticoidi e rappresenta un problema sanitario importante6; Pertanto, è importante studiare l'impatto di immunosoppressione sul tessuto osseo in grande dettaglio. Negli ultimi anni sono stati sviluppati vari modelli di zebrafish a che fare con la patogenesi di GIO. Perdita dell'osso glucocorticoide-mediata è stata indotta in larve di zebrafish, ad esempio, che ha portato all'identificazione di composti contromisure aumentando la massa di una droga schermo7. Inoltre, gli effetti inibitori dell'osso indotta da glucocorticoidi hanno stati imitati in zebrafish scale sia in vitro che in vivo8,9. Queste analisi sono molto convincenti approcci, soprattutto quando si tratta per l'identificazione di nuovi farmaci immunosoppressivi e osso anabolizzanti. Tuttavia, solo in parte prendono in considerazione l'endoscheletro e non sono stati eseguiti in un contesto rigenerativo. Pertanto, non consentono l'indagine degli effetti glucocorticoide-mediata durante rapida modalità di formazione dell'osso adulto, rigenerativa.
Qui, presentiamo un protocollo che consente ai ricercatori di studiare glucocorticoide-mediata effetti sulle ossa di zebrafish adulto in fase di rigenerazione. Modelli di lesione includono l'amputazione parziale della pinna caudale zebrafish, trapanazione del cranio, così come la creazione delle fratture di pinna ray (Figura 1A-1 C) e sono combinati con glucocorticoidi esposizione tramite incubazione (Figura 1E ). Abbiamo recentemente utilizzato una parte del presente protocollo per descrivere le conseguenze dell'esposizione al prednisolone, uno dei farmaci comunemente prescritti del corticosteroide, il zebrafish adulto rigenerante pinna e cranio osseo10. In zebrafish, gestione di prednisolone porta alla proliferazione degli osteoblasti in diminuzione, differenziazione degli osteoblasti incompleta e rapida induzione dell'apoptosi nel lignaggio del monocito/macrofago10. In questo protocollo, descriviamo anche come fratture possono essere introdotta nella singola aletta ossuta ray segmenti11, come questo approccio può essere utile quando si studia glucocorticoide-mediata effetti sull'osso che si verificano durante la riparazione di frattura. I metodi presentati qui contribuiranno all'ulteriore indirizzo base dei meccanismi di azione glucocorticoide in rapida rigenerazione dell'osso e possono essere impiegati anche in altri contesti sistemica di somministrazione del farmaco nel contesto della rigenerazione dei tessuti di zebrafish.

<table><tbody><tr><td>Prednisolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6004</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Etil-3-amminobenzoato metanosolfonato (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Pinza smussata</td><td>Aesculap</td><td>BD027R</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fine</td><td>Dumont</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Ago per iniezione 840004 Biozym 5518059</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Agarose</td></tr><tr><td>Braun (0,3 mm x 13 mm)</td><td>BD Beckton Dickinson</td><td>30400</td><td></td></tr><tr><td>Micro drill</td><td>Cell Point Scientific</td><td>67-1000</td><td>distribuito es. da Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Frese in acciaio (0,5 &micro; m diametro)</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Artemia ssp.</td><td>Sanders</td><td>425GR</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur (plastica, Pastette)</td><td>Alpha Labs</td><td>LW4111</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Alizarina rosso S polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Alcian blue 8 GX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>MZ16 FA</td><td>con fotocamera QIMAGING RETIGA-SRV</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>con fotocamera Olympus DP71 o DP80</td></tr></tbody></table>

modelli di lesione di zebrafish adulto per studiare gli effetti del prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish sono in grado di rigenerare i vari organi, tra cui appendici (pinne) dopo l'amputazione. Ciò comporta la rigenerazione dell'osso, che ricresce entro circa due settimane dopo la ferita. Inoltre, zebrafish sono in grado di guarire rapidamente dell'osso dopo la trapanazione del cranio e riparare le fratture che possono essere facilmente introdotto nei raggi della pinna ossuta di zebrafish. Queste analisi di lesioni rappresentano fattibile paradigmi sperimentali per testare l'effetto dei farmaci somministrati su rapidamente formando dell'osso. Qui, descriviamo l'uso di questi modelli di 3 lesioni e loro uso combinato con il trattamento glucocorticoide sistemica, che esercita gli effetti immunosopressivi ed inibitoria dell'osso. Forniamo un flusso di lavoro su come prepararsi per il trattamento immunosopressivo in zebrafish adulto, illustrano come eseguire pinna amputazione, trapanazione delle ossa calvarial e fratture pinna e descrivere come l'uso di glucocorticoidi influenzano entrambi osso formazione osteoblasti e cellule della linea monocito/macrofago come parte dell'immunità innata nel tessuto osseo.

Il protocollo presentato qui è stato utilizzato ripetutamente per indurre la formazione rapida dell'osso nel corso della rigenerazione del zebrafish pinna e cranio10,11,16. In combinazione con il metodo di somministrazione di prednisolone, studi sugli effetti di prednisolone durante la rigenerazione dell'osso possono essere perseguiti. Ad esempio, studi sulla formazione dell'osso e mineralizzazio...

Qui, descriviamo 3 modelli di lesione di zebrafish adulto e loro uso combinato con il trattamento di droga immunosopressiva. Siamo fornire indicazioni su formazione immagine di rigenerare i tessuti e il rilevamento di mineralizzazione dell'osso in esso.

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'intervento terapeutico immunosoppressivo per lo studio degli effetti avversi dei farmaci sulla rigenerazione tissutale, in particolare nelle ossa. Il principale vantaggio di questa tecnica è che combina modelli passati di rigenerazione ossea zebrafish con esposizione sistemica al farmaco mediante immersione del pesce zebra ferito in acqua di pesce integrata nel farmaco. Prima di iniziare la procedura, l'autoclave di un foglio di alluminio copriva un bicchiere da 600 millilitri per Zebrafish e un numero appropriato di bottiglie di vetro di acqua di pesce per l'esperimento e preparava il farmaco immunosoppressivo in soluzioni sperimentali di controllo di interesse.Per una lesione da amputazione, utilizzare forcep smussate per posizionare con cura un zebrafish anestetizzato sul lato laterale sul coperchio inverso di una piastra di Petri di 100 millimetri e utilizzare un bisturi per resect 50% della pinna. Quindi mettere il pesce in un bicchiere autoclavato contenente 300 millilitri di acqua di pesce integrato con un agente sperimentale appropriato e coprire il becher con un foglio per evitare la fuga di Zebrafish. Per indurre una lesione alla frattura della pinna, posizionare un zebrafish anestetizzato sul lato laterale in una piastra di Petri rivestita di agarosio di 100 millimetri sotto un microscopio sezionante e spingere leggermente un ago di iniezione in un segmento di raggi di pinna ossea fino a quando non appare una crepa.È importante introdurre non troppe fratture nella pinna perché ciò potrebbe compromettere notevolmente la stabilità. Quindi trasferire il pesce in un bicchiere autoclavato contenente 300 millilitri di acqua di pesce integrati con l'agente sperimentale appropriato. Per generare una lesione al cranio calvariale, tenere un zebrafish anestetizzato in posizione verticale in modo che le ossa calvariali siano facilmente visualizzate al microscopio a dissezione.Posizionare un micro trapano rotante dotato di una punta di perforazione di 500 micrometri sopra il centro dell'osso frontale e toccare delicatamente l'osso per produrre un foro delle dimensioni della bave del micro trapano. È fondamentale non spostare lateralmente il trapano durante la produzione della lesione e fermarsi immediatamente una volta che la resistenza del tessuto cade. Altrimenti, il cervello sarà danneggiato.Quindi mettere il pesce in un bicchiere autoclavato contenente 300 millilitri di acqua di pesce integrati con l'agente sperimentale appropriato. Cambiare l'acqua nei becher ogni giorno trasferendo il pesce zebra e l'acqua di pesce in un contenitore temporaneo appropriato e riempiendo il becher con acqua di pesce integrata con droghe fresche. Quindi usa una rete di pesce per riportare il pesce zebra al suo becher.Per trattamenti della durata totale fino a due giorni, non nutrire gli Zebrafish. Durante gli esperimenti più lunghi, dai da mangiare allo Zebrafish con da 0,5 a un millilitro di Artemia SSP tratteggiata ogni secondo giorno. Per l'analisi delle lesioni alla pinna, raccogliere la fine e utilizzare forcep fini per afferrare la pinna su un bordo del ceppo.Utilizzare un secondo paio di forcelle per afferrare il bordo del ceppo opposto e premere leggermente il tessuto sul fondo del piatto che contiene freddo 4%PFA per 10-20 secondi. Ripetere l'appiattimento delle pinne se necessario. La pinna ora dovrebbe giacere piatta senza arricciarsi.Per la conservazione a lungo termine del campione dopo la fissazione, lavare il tessuto con tre lavaggi PBS di 20 minuti e una serie crescente di metanolo. I campioni possono quindi essere conservati in metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius. Per la colorazione rossa di Alizarina, il metanolo reidrato ha immagazzinato campioni in una serie di metanolo discendente seguita da due lavaggi di 20 minuti in PBS e un lavaggio di cinque minuti in acqua deionizzata.Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere la soluzione di Alizarin Red al tessuto campione e incubare il campione a temperatura ambiente con dondolo per l'appropriato periodo di colorazione. Per cancellare i campioni, trattare il tessuto con la diminuzione dell'1% di idrossido di potassio serie di glicerolo. Quindi conservare i campioni in una soluzione di idrossido di potassio da uno a uno allo 0,1% all'80% di glicerolo e montare i tessuti con l'80% di glicerolo per l'immaginazione.Per la colorazione Calcein, incubare fino a tre Zebrafish contemporaneamente in soluzione di Calcein da 100 millimetri per 20 minuti in un bicchiere ricoperto di foglio di alluminio. Alla fine dell'incubazione, trasferire il pesce zebra in un contenitore di acqua di pesce e lasciare che il pesce nuoti brevemente prima di trasferirli in un nuovo contenitore di acqua di pesce. Dopo 20 minuti nel secondo becher per acquisire immagini dal vivo di rigenerazioni di pinne, posizionare un zebrafish anestetizzato su una piastra di Petri rivestita di agarosio e osservare la pinna tramite microscopia stereo.Per acquisire immagini delle ossa del cranio rigeneranti, posizionare il pesce zebrato in posizione verticale in una spugna e immagini il cranio mediante microscopia a fluorescenza. Il trattamento con Prednisolone, simile ad altri glucocorticoidi, porta ad un'inibizione generale della rigenerazione delle pinne compresa la formazione ossea come rilevato dalla colorazione rosso alizarina del tessuto delle pinne caudali fisse. Allo stesso modo, il farmaco ha un effetto ritardante sulla chiusura della lesione cranica calvariale.A causa dell'immunosoppressione, il numero ridotto di macrofagi può anche essere rilevato mediante immunoistochimica su sezioni di tessuto congelato come evidenziato dall'uso di colorazione anticorpale anti-mCherry e anti-GFP e MPEG-1 mCherry transgenico incrociato con Osterix NGFP Zebrafish su campioni di tessuto craschi zebrafish di animali trattati con Prednisolone. Durante il tentativo di queste procedure è importante ridurre al minimo la variabilità della velocità di rigenerazione ossea eseguendo i saggi di lesione in modo altamente riproducibile. È anche fondamentale ospitare singolo Zebrafish in becher autoclavati contenenti acqua di pesce autoclavata al fine di evitare infezioni microbiche.Questo protocollo contribuirà ad affrontare ulteriormente i meccanismi sottostanti dell'azione glucocorticoide. Ad esempio, nel contesto dell'osteoporosi indotta da glucocorticoidi e può anche essere adattato per l'uso di altri farmaci e di altri ossa di Zebrafish.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Per far luce sui meccanismi cellulari e molecolari della neurogenesi e della rigenerazione adulta del pesce zebra, abbiamo sviluppato un protocollo per la chirurgia invasiva che causa lesioni meccaniche nel telencefalo adulto del pesce zebra e il successivo monitoraggio dei cambiamenti nell'emisfero pugnalato mediante immunoistochimica o ibridazione in situ.

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

Qui presentiamo un metodo affidabile per studiare la rigenerazione renale adulta inducendo un danno renale acuto mediante iniezione di gentamicina. Dimostriamo che il danno dipende dal dosaggio di gentamicina e dalla temperatura ambientale utilizzando l'ibridazione in situ per marcare lhx1a+ sviluppando nuovi nefroni.

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Qui, presentiamo un protocollo per il trapianto cellulare del muscolo scheletrico del pesce zebra e del rabdomiosarcoma embrionale (ERMS) in un pesce zebra adulto immune compromesso rag2E450fs omozigote mutante. Questo protocollo consente l'analisi efficiente della rigenerazione e della trasformazione maligna delle cellule muscolari.

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La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

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Abbiamo modificato il modello di calo di peso di Marmarou per il pesce zebra adulto per esaminare un'ampia gamma di patologie a seguito di lesioni cerebrali traumatiche da forza contundente (TBI) e i meccanismi alla base della successiva rigenerazione neuronale. Questo modello di TBI a forza smussata è scalabile, induce un TBI lieve, moderato o grave e ricapitola l'eterogeneità delle lesioni osservata nel TBI umano.

Un modello scalabile per studiare gli effetti della lesione da forza smussata nel pesce zebra adulto

Viene descritto un modello di lesione cerebrale meccanica nel pesce zebra adulto per studiare i meccanismi molecolari che regolano la loro elevata capacità rigenerativa. Il metodo spiega di creare una ferita da taglio nel tectum ottico di più specie di piccoli pesci per valutare le risposte rigenerative utilizzando l'immunocolorazione fluorescente.

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Questo protocollo descrive la raccolta e la visualizzazione delle squame elasmoidi del pesce zebra durante la rigenerazione in vivo . Inoltre, viene presentata la coltura ex vivo di queste scaglie fino a 7 giorni dopo la raccolta.

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Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

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