In Vivo a due colori immagini fotone di cellule reporter geneticamente taggate nella pelle

I cambiamenti morfologici si verificano nelle cellule fibroblaste immunitarie dopo l'attivazione e promuovono alterazioni nel reclutamento cellulare. Utilizzo dell'imaging a 2 fotoni in combinazione con una proteina specifica fibroblasta geneticamente ingegnerizzata 1 (FSP1)-cre; tdTomato- linea di mouse flossa-stop-floxed ^(TB/TB) e verde fluorescente etichettato lipopolysaccharide-FITC, possiamo illustrare l'assorbimento altamente specifico di lipopolissaccharide nei fibroblasti dermici e cambiamenti morfologici in vivo.

Il nostro protocollo ci consente di visualizzare come le cellule contrassegnate fluorescentmente rispondono a uno stimolo periferico infiammatorio in un animale vivo in tempo reale. L'imaging a 2 fotoni consente la visualizzazione in profondità nel tessuto di un campione vivo, preservando l'integrità delle loro cellule e del loro microambiente e fornendo una rappresentazione accurata del sistema biologico. Respirare muove la zampa nel tempo, causando sfocatura e perdita del piano focale.

Assicurarsi di apporre saldamente la zampa con nastro adesivo su una superficie stabile prima dell'imaging. In questo è necessario essere in grado di trovare un piano di interesse appropriato, assicurarsi che l'obiettivo sia vicino alla zampa senza toccare ed è direttamente sopra il sito di iniezione. Prima di iniziare la procedura, attivare il sistema multi-fotone e selezionare il 25X soggettivo.

Posizionare un apparato stereotassico sullo stadio del microscopio multi-fotone e collegare l'apparecchio a una macchina per la somministrazione di anestesia. Posizionare un pezzo di carta nera opaca sulla superficie dell'apparecchio come punto di connessione per la zampa del mouse. Impostare lo scanner di risonanza con un'area di scansione fissa di 512 x 512 micrometri.

Sintonizzare i laser di eccitazione sulle lunghezze d'onda di eccitazione 930 e 1,100 nanometriche rispettivamente per i segnali proteici fluorescenti verdi e rossi. Utilizzare uno specchio dicroico da 690 a 1.050 nanometri per dirigere il percorso della luce di entrambi i laser di eccitazione verso il singolo obiettivo consentendo al laser di eccitazione sintonizzato da 930 nanometri di essere riflesso allo scanner principale e al laser sintonizzato da 1.100 nanometri per passare direttamente nello scanner principale. Quindi impostare la potenza laser di FITC sul 5% e la proteina fluorescente verde sul 20% e spegnere le luci aeree.

Per l'imaging in vivo, anestetizza il mouse e delineato nel protocollo di testo. Confermare la mancanza di risposta al dito del mouse anestetizzato e posizionare il mouse nell'apparato stereotassico con accesso a un cono nasale. Utilizzare il nastro nero per apporre saldamente la zampa posteriore sul pezzo di carta nera su aree prossimali e distali all'area di interesse, assicurandosi che la superficie plantare della zampa non sia strutturata e rivolta verso l'obiettivo.

Posizionare una generosa quantità di lubrificante a base d'acqua sulla superficie plantare della zampa. Toccare l'obiettivo del lubrificante per creare una colonna di liquido tra la zampa e l'obiettivo. Utilizzare la luce di eccitazione FITC per mettere a fuoco lo strato dermico della zampa, confermando che è possibile visualizzare i fibroblasti taggati con pomodoro del dimero tandem.

Immagine dell'area delle cellule situate appena sotto la superficie plantare della zampa posteriore con entrambi i laser. Acquisire un intervallo di tempo di 15 minuti di circa cinque-10 Z-slice a circa un micrometro per fetta per stabilire una rappresentazione di base dell'ambiente. Una volta ottenuta l'imaging di base, caricare una siringa Hamilton in vetro da 25 microlitri con cinque microgrammi di lipopolysaccaride coniugato FITC, o LPS, per 20 microlitri di PBS.

Somministrare la soluzione per iniezione intraplantare nella zampa posteriore sperimentale senza disturbare la posizione della zampa. Quindi immagine di un'area di cellule situata appena sotto la superficie plantare della zampa posteriore con entrambi i laser. Acquisire un intervallo di tempo da 60 a 120 minuti di circa cinque-10 fette Z a circa un micrometro per fetta per identificare l'assorbimento intraplantare mediato cellulare di LPS FITC.

Poiché non vi è alcuna fluorescenza intrinseca da parte delle cellule all'interno dello strato dermico, si può osservare una miriade di cellule nello strato dermico della zampa posteriore che assumono LPS contrassegnato fluorescentmente dopo iniezione intraplantare in un topo di tipo selvatico. Dopo l'iniezione LPS FITC, solo la proteina specifica dei fibroblasti uno fibroblasto positivo che esprime pedaggio come il recettore quattro lega e assorbimento della proteina iniettata con un alto livello di co-localizzazione con un tag di pomodoro dimero tandem espresso da queste cellule. Al contrario, i topi che hanno un pedaggio come il recettore quattro eliminato da tutto il corpo non si legano e prendono LPS dopo l'iniezione.

Infatti, le sagome cellulari sono visibili dopo l'iniezione FITC LPS che indica che il farmaco si sta disperdendo nel fluido interstiziale intorno alle cellule, ma in realtà non è legato da un recettore. La cosa più importante da ricordare in questo protocollo è garantire che la zampa sia immobilizzata in modo che non ci siano distorsioni nel video a causa del movimento o della respirazione. Utilizzando questa procedura, è possibile tracciare il reclutamento di cellule contrassegnate fluorescentmente in un'area dopo la lesione e i cambiamenti morfologici nella risposta di una cellula a uno stimolo nel tempo.

Quindi l'imaging a 2 fotoni consente ai ricercatori di combinare topi reporter genetici e composti contrassegnati fluorescentmente per valutare cosa succede in un animale vivo dopo un'iniezione.