Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Questo protocollo consente di rilevare mutazioni associate al tumore e attualmente completa le procedure chirurgiche invasive. Un altro punto di forza è la capacità di utilizzare questo protocollo per monitorare il carico di mutazioni tumorali straordinario. La tecnica consente la genotipizzazione del tumore senza richiedere una vera biopsia chirurgica del tessuto, che è particolarmente utile per i tumori in luoghi difficili, come il tronco encefalico con accesso limitato ai tessuti.

In assenza di biopsia ripetuta, i dati molecolari longitudinali non sono disponibili per completare la risonanza testr. Il monitoraggio digitale della PCR facilita un integratore molecolare alla diagnosi, consentendo un processo decisionale di trattamento più informato. Metodi simili possono essere utilizzati per rilevare l'espressione dei geni in particolare sistema, con sonde convenzionali fluo-4 e collegate a quencher ma con una sensibilità maggiore rispetto alla PCR quantitativa.

Prima di iniziare la procedura PCR digitale droplet, pulire lo spazio del banco e le attrezzature con 10% candeggina e 70% etanolo e delicatamente vortice e centrifugare brevemente tutti i reagenti, ad eccezione dell'olio stabilizzatore della goccia. Verificare che la bombola di gas azoto compresso sia attaccata allo strumento di generazione delle goccioline e che il serbatoio del cilindro sia impostato a 90 libbre per pollice quadrato. E 38 microlitri di miscela di reazione PCR digitale direttamente nella parte inferiore di ogni pozzo di una striscia di tubi PCR a otto pozza, rimuovendo eventuali bolle con una punta di pipetta pulita.

Aggiungere 12 microlitri di campione di DNA preamplificato in triplice copia ai pozzi appropriati della striscia del tubo. Pipettare delicatamente l'intero volume 10 volte per mescolare la miscela di reazione con il campione di DNA e pipettare l'intero volume da ogni pozzo nei corrispondenti canali da A a H di un chip dello strumento generatore di goccioline. Inserire una nuova striscia di tubi PCR nello strumento di generazione delle goccioline e scansionare l'ID del chip dello strumento generatrice di goccioline nel software sul computer dello strumento.

Quindi fare clic su Avvia esecuzione per iniziare a gocciolineare gli esempi. Al termine della goccioline, rimuovere la striscia del tubo PCR e applicare i tappi a strisce del tubo. Trasferire la striscia del tubo su un ciclore termico ed equilibrare il tubo con un'altra striscia di tubo contenente 80 microlitri di acqua per pozzo.

Quindi eseguire il ciclore termico nelle condizioni di ciclo termico appropriate. Sostituire i tappi per strisce con tappi ad alta velocità. Al termine del ciclo termico, trasferire la striscia del tubo allo strumento di quantificazione, fare clic su Imposta una corsa sul software dello strumento e posizionare la striscia del tubo nello strumento di quantificazione.

Posizionare lo scudo metallico sopra un nuovo chip dello strumento di quantificazione, scansionare l'ID del chip nello strumento e inserire il chip nella macchina. Chiudere il coperchio dello strumento. Nel software del computer immettere un nome per l'esecuzione pcr digitale e per ciascuno degli otto canali, quindi selezionare Modalità rapida e fare clic su Avvia per iniziare la quantificazione.

Per analizzare i dati spettrali grezzi, avviare il software dell'analista e aprire i file fcs. In vista analisi selezionare intatto. In visualizzazione di esempio fare clic sulle caselle accanto a ciascuno degli otto campioni.

Il software traccia i segnali rispettivamente per gli alleli mutanti e di tipo selvaggio lungo l'asse x e y. Utilizzare la funzione matrice calcolata per applicare la compensazione spettrale sulle goccioline intatte, come da istruttori produttori e regolare le impostazioni dell'asse sotto le opzioni dell'asse. Impostare l'asse x su un minimo di zero e un massimo di 30.000 e l'asse y su un minimo di meno 5.000 e un massimo di 10.000.

Quando i cluster di goccioline sono stati identificati, regolare l'asse per ridurre lo spazio vuoto nel grafico. Selezionare il campione corrispondente al DNA genomico del tessuto tumorale di controllo positivo per impostare le porte negative mutanti e di tipo selvaggio, assicurando che gli ammassi siano distinti e facilmente identificabili. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Applica tutte le impostazioni agli esempi selezionati per applicare le impostazioni del gate per il controllo positivo a tutti i campioni.

Sotto la vista grafica, fate clic su più campioni per visualizzare i grafici per tutti gli esempi selezionati ed esportare l'immagine come file tif. Quindi, in Area di lavoro, selezionare Esporta analisi e salvare il file di dati analizzato come file CSV. Qui, vengono mostrati risultati rappresentativi per un rilevamento riuscito di una mutazione in un DNA privo di plasma pre-amplificato e cellule di liquido cerebrospinale da due bambini con gliomi midline diffusi.

In questo esperimento, una netta separazione tra gli ammassi di tipo mutante e selvaggio può essere osservata rispettivamente lungo l'asse x e y. Robusti ammassi di tipo selvatico indicano che l'estrazione del DNA senza cellule ha avuto successo perché è presente dna modello. Per questi pazienti, gli ammassi mutanti mostrano una frequenza allelica di mutazione dell'1,6 e del 39,32% rispettivamente per i campioni di plasma e liquido cerebrospinale in conformità con lo stato di mutazione tumorale come confermato dall'analisi genomica del tessuto tumorale biopsied.

Il controllo negativo, d'altra parte, mostra zero goccioline mutanti e zero di tipo selvatico che indicano che non c'è stata contaminazione della miscela di reazione PCR. Il DNA genomico del tessuto tumorale a controllo positivo mostra la mutazione rilevata alla frequenza allelica prevista per il particolare campione tumorale selezionato. L'assenza di rilevamento di mutazioni all'interno del plasma potrebbe non essere necessaria significa che un paziente è di tipo selvaggio per la mutazione di interesse in quanto si verificano falsi negativi.

Ad esempio, in questo paziente, sebbene la mutazione di interesse non sia stata rilevata, lo stato di mutazione è stato confermato dall'analisi genomica del tessuto tumorale. La PCR è una tecnica molto sensibile che richiede una frequente decontaminazione dell'area di lavoro e delle attrezzature per evitare l'acquisizione di dati falsi positivi.