Name: Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Impara la coltura primaria di neuroni cerebellari da embrioni di topo per studiare lo sviluppo neuronale in vitro. Questo metodo consente di analizzare caratteristiche cellulari e funzioni in condizioni controllate.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questi studi sono stati sostenuti da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (HM: NSERC Discovery Grant - RGPIN-2018-06040), e del Children Hospital Research Institute di Manitoba (HM: Grant n. 320035), e della ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson Translational Team Grant (JK, HM).

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le normative istituzionali e la Guida alla cura e all'uso degli animali sperimentali del Canadian Council for Animal Care ed è stata approvata dalle autorità locali ("il Bannatyne Campus Animal Care Commissione"). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero e la sofferenza degli animali utilizzati. Un'adeguata profondità di anestesia è stata confermata osservando che non vi è stato alcun cambiamento nella frequenza respiratoria associata alla manipolazione e al pizzico o al riflesso corneale.
1. Preparazione
NOTA: programmare la fornitura di topi incinta a tempo, in base al piano di ricerca, per la E12–E18 post-concetto. La scelta della temporizzazione dipende dalle caratteristiche delle celle desiderate (vedere di seguito). Preparare i coperchi di copertura e le piastre almeno 2 giorni prima dell'esperimento. Poly-L-ornitine viene utilizzato come materiale di rivestimento per migliorare l'attaccamento cellulare agli scivoli di copertura.
<ol><li>Cappotto il coperchio scivola 2 giorni prima dell'isolamento cellulare.<ol>
<li>Collocare i coperchi rotondi in una piastra da 24 pozzetti, in condizioni sterili in un armadietto di biosicurezza. Lasciare un divario tra ogni slittamento di copertura per evitare qualsiasi contaminazione.</li>
<li>Aggiungete 90 l di poli-L-ornitina (PLO, 500 g/mL) al centro di ogni cover slip. Chiudere il tappo e posizionare delicatamente la piastra in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi per 2 giorni. NOTA: un volume maggiore può fuoriuscire dagli scivoli di copertura durante l'incubazione. La cover slip non deve essere completamente coperta con LLo dopo aver inserito una goccia. Durante l'incubazione notturna, l'OLP distribuisce equamente sul bordo delle schedini di copertura.</li>
</ol>
</li>
<li>Un giorno prima dell'isolamento cellulare, preparare il mezzo di coltura I (DMEM/F-12 contenente putrescina 100 m, sodio selenite 30 nM, L-glutammina 3,9 mM, gentamicin 3,5 g/mL, tri-iodothyronine (T3) 0,5 ng/mL e supplementi N3 [progesterone 4M, insulina 20g/mL, transferrin 20 mg/mL)) e mezzo di seeding (medio di coltura I [senza N3 e T3] contenente 10% siero bovino fetale [FBS]) e conservarli in 4 gradi centigradi. Preparare la soluzione di lavoro trypsin (0,25%) In DMEM/F12 e mantenerlo a 4 gradi centigradi. NOTA: le composizioni medie sono riportate nella Tabella 1.</li>
<li>Il giorno dell'isolamento cellulare, posizionare il mezzo di coltura I e il mezzo di semina nell'incubatrice a 37 gradi centigradi. NOTA: prima di iniziare l'isolamento del cervelletto, assicurarsi che tutti gli utensili e le superfici di lavoro siano sterili.</li>
<li>Lavare i coperchi.<ol>
<li>Togliere la piastra 24 dell'incubatrice.</li>
<li>Lavare i coperchi del coperchio nella piastra 3x del pozzo 24 con acqua a doppia distillazione (DDW) in un armadietto di biosicurezza in condizioni sterili. Ogni volta lasciare che il coperchio scivola in ammollo in DDW per 5 min prima di iniziare l'aspirazione.</li>
<li>Lasciare il coperchio del coperchio in un armadio di biosicurezza per almeno 2 h per asciugare completamente.</li>
</ol>
</li>
</ol>2. Collezione Cervelletto
<ol><li>Preparare tre piatti Petri in plastica sterile da 10 cm pieni di salina ghiacciata 1x tamponata da fosfati (PBS), 3 piatti Petri pieni di soluzione di sale bilanciato 1x Hank (HBSS) e circa 5 piatti Petri pieni di mezzi di dissezione ghiacciati (1x HBSS) contenente gentamicin 10 g/mL). Tienili sul ghiaccio.</li>
<li>Anestesizzare il topo incinta E18 CD1 con 40% isoflurane. Eseguire lussazione cervicale sul mouse. Sterilizzare l'addome con una soluzione di etanolo del 70%.</li>
<li>Utilizzare un paio di forbici per fare un'incisione cutanea dalla simfia pubica al processo xifoide. Quindi tenere la pelle con pinze e aprire la cavità addominale.</li>
<li>Accisa le corna uterine con pinze e lavelatridimensionale 3x nel 1x PBS ghiacciato sul ghiaccio. NOTA: I seguenti passaggi devono essere condotti tutti sul ghiaccio per ridurre al minimo il tasso metabolico e prevenire danni ai tessuti e alle cellule.</li>
</ol>3. Dissecting il cervelletto
<ol><li>Dopo l'ultima fase di lavaggio, l'uso di un paio di pinze sottili separano gli embrioni dall'utero in 1x HBSS e li trasferiscono sul mezzo di dissezione ghiacciato. Nel mezzo di dissezione, decapitare gli embrioni con le forbici. Collocare il tessuto in un mezzo di dissezione pulito. NOTA: l'utilizzo di uno stereoscopio per la microdissezione è facoltativo.</li>
<li>Tenere il cranio con pinze sottili e tagliare il calvario con un paio di piccole forbici dall'aspetto laterale del cranio in una linea dal forame magnum al meatus acustico esterno e bordo inferiore della cavità orbitale. NOTA: Prendendo questo passo espone la cavità cranica a livello della base del cranio e rende più facile rimuovere il cervello.</li>
<li>Usando un paio di pinze sottili, rimuovi la base del cranio e staccate il cranio dal cervello.</li>
<li>Rimuovere con attenzione le meningi sul cervelletto, a partire dalla superficie laterale del peduncolo cerebellare centrale e pons.</li>
<li>Tagliare entrambi i peduncoli cerebellari e separare il cervelletto dal resto del cervello (Figura 1).</li>
<li>Posizionare immediatamente la cerebella raccolta in uno sterile tubo conico da 15 mL riempito con 14 mL di DMEM/F12 sul ghiaccio.</li>
<li>Centrifugare il tubo a 1.000 x g, 4 gradi C per 1 min, 3x. Rimuovere delicatamente il supernatante con una pipetta e risospendere il pellet in fresco, ghiacciato DMEM/F12. NOTA: Per evitare di perdere i campioni, utilizzare l'aspirazione dell'armadio il meno possibile.</li>
</ol>4. Dissociazione del cervelletto
<ol><li>Aggiungere 2 mL di prova preriscaldato (37 gradi centigradi) al pellet dal punto 3.7 e convogliare delicatamente per un'adeguata miscelazione.</li>
<li>Collocare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 12 min.</li>
<li>Dopo l'incubazione, portare il tubo in un armadietto di biosicurezza e aggiungere 10 mL di DMEM/F12 per inattivare la trypsin.</li>
<li>Centrifugare la miscela a 1.200 x g per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in DMEM/F12 fresco. Ripetere 3x.</li>
<li>Prewet un tubo di trasferimento di plastica sterile con DMEM/F12.</li>
<li>Dopo il lavaggio e la centrifugazione finale, aggiungere 3,5 mL di soluzione di lavoro DNase (1 mL di soluzione stock DNase I [0.05% DNase - 12 mM MgSO4 x 1x HBSS] in 500 l di FBS inattivato dal calore e 2 mL di DMEM/F12) al pellet nello stesso tubo.</li>
<li>Triturare il tessuto con un pipet almeno 30x fino a quando la miscela raggiunge un colore lattiginoso omogeneo.</li>
</ol>5. Raccolta di celle
<ol><li>Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 ghiacciato alla miscela.</li>
<li>Centrifugare il campione a 1.200 x g, 4 gradi centigradi per 5 min.</li>
<li>Rimuovere con attenzione il supernatante senza disturbare il pellet.</li>
<li>Rimuovere il supporto di seeding dall'incubatrice.</li>
<li>Aggiungere al pellet 500 l l di mezzo di semina preriscaldato e mescolare molto bene utilizzando un pipet per risospendere le cellule.</li>
<li>Contare le cellule usando un emocitometro.</li>
<li>Diluire la sospensione cellulare con il mezzo di semina a una densità di 5 x 105 celle / mL.</li>
<li>Sotto un armadietto di biosicurezza, aggiungere 90 l della miscela diluita ad ogni pozzo al centro dello slitta di copertura. NOTA: non caricare le particelle che non sono stati sospesi nel DNase.</li>
<li>Collocare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi centigradi per 3/4 h.</li>
<li>Dopo l'incubazione, aggiungere 500 l of prewarmed culture medium I ad ogni pozzo e riporre la piastra nell'incubatrice (37 gradi centigradi).</li>
</ol>6. Trattamento delle cellule recuperate
<ol><li>Dopo 7 giorni, sostituire il vecchio mezzo con il medio di coltura fresco II (medio di coltura Ho integrato con citosina arabinoside [Ara-C, 4 M] e 100 album del siero bovino g/mL [BSA]; vedi tabella 1). NOTA: Questo passaggio è fondamentale per evitare la crescita delle cellule non neuronali.</li>
<li>Monitorare il mezzo di coltura una volta al giorno. Se il pH cambia (indicato da un marcato cambiamento di colore, di solito più giallo), rimuovete la metà (quasi 250 gradi) del vecchio mezzo da tutti i pozzi e aggiungete 300 l di mezzo di coltura preriscaldato I a ciascuno di essi per evitare la perdita di nutrienti. NOTA: Il fenolo rosso nel mezzo di coltura è un buon indicatore del pH del mezzo e dell'attività delle cellule. Cercare di ridurre al minimo il tempo di esposizione delle cellule al di fuori delle condizioni di incubatrice. Questo previene qualsiasi stress che potrebbe influenzare la loro vitalità.</li>
</ol>7. Raccolta e fissazione delle cellule
NOTA: A seconda del progetto sperimentale, le cellule possono essere raccolte in qualsiasi giorno, in qualsiasi momento.
<ol><li>Preparare una piastra di 24 pozze separate con l'organizzazione numerica corrispondente e aggiungere 100 -L di 4% paraformaldeide (PFA) ad ogni pozzo.</li>
<li>Per raccogliere le cellule nei giorni desiderati (a seconda del protocollo sperimentale), rimuovere delicatamente gli slittamenti di copertura dai pozzetti della piastra di coltura originale e metterli nei corrispondenti pozzi della piastra riempita da PFA.</li>
<li>Aggiungere PFA ai pozzi per immergere completamente i copricopro. NOTA: Per evitare il distacco delle celle dalla distinta di copertura, non aggiungere l'APFa direttamente sulla distinta di copertura.</li>
<li>Mantenere la piastra PFA a 4 gradi centigradi per 30-120 min.</li>
<li>Dopo l'incubazione, ripristinare la piastra a temperatura ambiente.</li>
<li>Lavare delicatamente il coperchio 3x per 5 min con 1x PBS.</li>
<li>Procedere al processo di immunostaining. NOTA: In questo studio, è stato utilizzato un microscopio a fluorescenza dotato di fotocamera per catturare le immagini e assemblato in montaggi utilizzando un'applicazione software di editing delle immagini.</li>
</ol>

<ol><li>Giffard, R. G., Ouyang, Y. B. Cell culture: primary neural cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGiffard%2C+RG+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22">Encyclopedia of Neuroscience</a>. Squire, L. R. , Academic Press. Cambridge, MA. 633-637 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Cross-Contamination+and+Misidentification+of+278+Widely+Used+Tumor+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines.</a> PLoS One. 12 (1), 0170384(2017).</li>
<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixing+problems+with+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Check+your+cultures%21+A+list+of+cross-contaminated+or+misidentified+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines.</a> International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).</li>
<li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+cycle%3A+the+neuron+itself+and+its+circumstances%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li>
<li>Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+a+breakthrough+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoloboueva%2C+L+%22Reference+Module+in+Neuroscience+and+Biobehavioral+Psychology%22">Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology</a>. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2017).</li>
<li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450(2014).</li>
<li>Sudarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascl1+genetics+reveals+insights+into+cerebellum+local+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).</li>
<li>Rahimi-Balaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrin+II+Is+Ectopically+Expressed+in+Microglia+in+the+Cerebellum+of+Neurogenin+2+Null+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice.</a> Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).</li>
<li>Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Migration+During+Development+of+the+Cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal Migration During Development of the Cerebellum.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484(2018).</li>
<li>Buffo, A., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+lineage+and+function+of+cerebellar+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Origin, lineage and function of cerebellar glia.</a> Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).</li>
<li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Precursor+Cells+from+the+Rhombic+Lip+Are+Specified+to+a+Cerebellar+Granule+Neuron+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li>
<li>Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Indispensable+Roles+of+Microglia+and+Astrocytes+during+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Human+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566(2016).</li>
<li>Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+culturing+cerebellar+Purkinje+cells+with+differentiated+dendrites+under+a+mixed+monolayer+setting.+Brain+research%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research.</a> Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).</li>
<li>Tabata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+method+for+culture+of+dissociated+mouse+cerebellar+cells+enriched+for+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).</li>
<li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+promotes+the+development+of+deep+cerebellar+nuclear+neurons+in+dissociated+mouse+cerebellar+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures.</a> Brain Research. 1141, 25-36 (2007).</li>
<li>Schaller, K. L., Caldwell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+distribution+of+voltage-gated+sodium+channels+in+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum.</a> Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).</li>
<li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+precursor+cells+from+the+rhombic+lip+are+specified+to+a+cerebellar+granule+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li>
<li>van der Valk, J., Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Bovine+Serum+%28FBS%29+-+A+pain+in+the+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).</li>
<li>Froud, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development%2C+benefits+and+disadvantages+of+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">The development, benefits and disadvantages of serum-free media.</a> Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).</li>
<li>Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cell+passage+number+on+osteogenic+and+adipogenic+characteristics+of+D1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells.</a> Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).</li>
<li>Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUysal%2C+O+%22Omics+Technologies+and+Bio-Engineering%22">Omics Technologies and Bio-Engineering</a>. Barh, D., Azevedo, V. , Academic Press. Cambridge, MA. 391-429 (2018).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3634(2012).</li>
<li>Nelson, K. B., Bauman, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thimerosal+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Thimerosal and autism.</a> Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).</li>
<li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+promotes+the+development+of+deep+cerebellar+nuclear+neurons+in+dissociated+mouse+cerebellar+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures.</a> Brain Research. 1141, 25-36 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'uso delle culture primarie è un metodo ben noto applicabile a tutti i tipi di neuroni17,18,19. Nel protocollo presentato, spieghiamo come isolare i neuroni cerebellari e mantenere la loro vitalità con la sopravvivenza ottimale in vitro per un massimo di 3 settimane. La coltura primaria delle cellule cerebellari, che sono state isolate all'E15-E18, conferma la raccolta di tre classi di grandi neuroni: PC, cellule Golgi e CN. I ...

Per diversi decenni, le linee cellulari sono state ampiamente utilizzate come strumento ad alto throughput negli studi preclinici e nella ricerca biologica. Convenienza, rapida crescita, e la riduzione dell'uso di animali vivi sono alcuni vantaggi dell'utilizzo di queste cellule. Tuttavia, alterazioni genetiche e cambiamenti fenotipici si accumulano dopo diversi passaggi in vitro1. L'errata identificazione delle linee cellulari e la dissimilità genetica dalle cellule primarie può portare a esperimenti irriproducibili e false conclusioni2,3,4,5. Pertanto, nonostante alcune somiglianze con cellule differenziate come i neuroni (ad esempio, neurotrasmettitori, canali ionici, recettori e altre proteine specifiche del neurone), le linee cellulari neuronali non possono replicare il fenotipo completo dei neuroni. Utilizzando neuroni maturi è un'altra opzione; tuttavia, queste cellule sono cellule postmitotiche non dividendo che sono difficili da propagare in coltura. Inoltre, il rientro nel ciclo cellulare può precipitare l'apoptosi6.
Sono state sviluppate colture cellulari tridimensionali (3D), colture di fette organotipiche e colture organoidi per fornire un ambiente in cui le cellule possono disporre in una forma 3D che imita l'ambiente in vivo. Così, la comunicazione cellula-cellula, la migrazione, l'invasione delle cellule tumorali nei tessuti circostanti e l'angiogenesi possono essere studiate7. Tuttavia, i costi aggiuntivi dell'utilizzo di proteine a matrice cellulare extra (ECM) o idrogel sintetici come biancheria da letto, difficoltà nell'imaging e compatibilità con strumenti di screening ad alta produttività sono notevoli inconvenienti della coltura cellulare 3D. Uno dei principali svantaggi della coltura della falce del tessuto organotipipico è l'uso di un gran numero di animali e gli effetti negativi dell'asotomia, che porta all'inaccessibilità degli obiettivi e ai fattori di crescita per gli assoni, e di conseguenza alla morte neuronale8.
Pertanto, un approccio alternativo, che evita i problemi con le linee cellulari, la difficoltà di far crescere le cellule mature e la complessità dei tessuti, è nella maturazione in vitro delle cellule primarie immature. Le cellule primarie sono derivate direttamente dal tessuto umano o animale e dissociate utilizzando metodi enzimatici e/o meccanici9. I principi principali di isolamento, seming, e la manutenzione in mezzo di coltura sono simili indipendentemente dalla fonte di tessuto. Tuttavia, i fattori trofici necessari per promuovere la proliferazione e la maturazione sono altamente specifici per le cellule6.
Conoscere la "data di nascita" di ogni tipo di cellula cerebellare è un prerequisito per la progettazione di un esperimento di coltura primaria. In generale, le cellule Purkinje (PC) e i neuroni dei nuclei cerebellari (CN), nascono prima delle cellule più piccole, compresi gli interneuroni (ad esempio, cesti, cellule stellate) e le cellule granule. Nei topi emergono PC tra il giorno embrionale (E)10–E13, mentre i neuroni CN a circa E9–E1210.
Altri neuroni cerebellari nascono molto più tardi. Ad esempio, nei topi, la sottopopolazione Golgi degli interneuroni è generata dal V, a (E14-E18) e gli interneuroni rimanenti (cellule del cestino e cellule stellate) situate nello strato molecolare emergono dalla divisione delle cellule progenitrici nella materia bianca tra le prime postnatale (P)0–P711. Le cellule di granulo sono generate dalla zona germinale esterna (EGz), una zona germinale secondaria che deriva dal labbro rombico rostrale e passa attraverso la divisione terminale dopo la nascita. Ma prima che i loro precursori sorgono dal labbro rombico dell'E13-E16, le cellule sono già migrati sontuosamente lungo la superficie del pia per creare un sottile strato di cellule sulla superficie dorsale dell'anlage del cervelletto. Le cellule macrogliali non neuronali come gli astrociti e gli oligodendrociti, che provengono dal neuroepitelio ventricolare, nascono rispettivamente a E13.5 e P0-P7rispettivamente 11,12,13,14 ,15. Le microglia sono derivate da cellule progenitrici mieloidi primitive di tuorlo-sac tra E8-E10 e dopo l'invasione nel sistema nervoso centrale possono essere rilevate nel cervello del topo da E916.
Il metodo presentato in questo articolo si basa su quello originariamente sviluppato da Furuya et al. e Tabata et al.17,18, che è stato ottimizzato per la coltura primaria delle cellule Purkinje derivate da Wistar rat cerebella. Ora abbiamo adattato questo metodo e attentamente modificato per studiare la crescita dei neuroni cerebellari del topo19. A differenza del nostro nuovo protocollo, il mezzo di dissezione a freddo è il buffer di lavaggio principale utilizzato durante le fasi di dissezione e dissociazione prima di aggiungere il mezzo di semina nel protocollo furuya17. Questo buffer manca la nutrizione, fattori di crescita, e ormoni (tutti nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco:miscela nutriente F-12 [DMEM/F12]) che sono necessari per sostenere la crescita cellulare e la sopravvivenza durante i passaggi di cui sopra. Inoltre, sulla base della nostra vasta esperienza con le colture cerebellari primarie murine, abbiamo usato 500 l di mezzo di coltura in ogni pozzo (invece di 1 mL) e aumentato la concentrazione di tri-iodothyronine a 0,5 ng/mL, che migliora la crescita delle cellule neuronali, in particolari di quelli con un fenotipo della cellula Purkinje, e promuove la crescita dei rami dendritici nella cultura. Il metodo principale descritto in questo articolo può essere ampiamente applicato ad altri piccoli roditori (ad esempio, scoiattoli e criceti) durante lo sviluppo embrionale e può essere utilizzato per studiare la neurogenesi cerebellare e la differenziazione nei vari stadi embrionali, che differiscono tra le specie.

<table><tbody><tr><td>Adobe Photoshop CS5 versione 12</td><td>Adobe Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>canale anti-sodio (SCN)PN4 (Nav1.6)</td><td>Sigma</td><td>S0438</td><td>3 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A3608</td><td></td></tr><tr><td>CALB1</td><td>Anticorpi svizzeri Swant (policlonali)</td><td>Diluizione CB38</td><td>1/5000</td></tr><tr><td>Anticorpi svizzeri CALB1</td><td>Swant (monoclonali)</td><td>Diluizione 300</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Citosina &beta;-D-arabinofuranoside o citosina arabinoside (Ara-C)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I da bovino pancreas</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per medicazione</td><td>Delasco</td><td>DF-45</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM-F12)</td><td>Lonza</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Vetrini di copertura: Circles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Soluzione salina bilanciata (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Insulina da pancreas bovino</td><td>Millipore sigma</td><td>I5500, I6634, I1882 e I4011</td><td></td></tr><tr><td>Forbice grande</td><td>Stoelting</td><td>52134-38</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Ematocitometro metallizzato</td><td>Hausser Bright-Line</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Microdissezione Pincipe</td><td>Merlan</td><td>624734</td><td></td></tr><tr><td>modello 5 Pinzetta</td><td>Dixon</td><td>291-9454</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399-26</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4638</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone (P4)</td><td>Millipore sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>PVALB</td><td>Swant Anticorpi svizzeri</td><td>235</td><td>Diluizione 1/1500</td></tr><tr><td>Samll Forbice</td><td>WPI Forbici Svizzere, 9cm</td><td>504519</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di Sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Tri-iodotironina (T3)</td><td>Millipore Sigma</td><td>T2877</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Microscopio a fluorescenza</td><td>Imager</td><td></td> <td>Zeiss</td> Z2</tr></tbody></table>

cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

L'uso delle colture cellulari primarie è diventato uno dei principali strumenti per studiare il sistema nervoso in vitro. L'obiettivo finale dell'utilizzo di questo sistema di modelli semplificato è quello di fornire un microambiente controllato e mantenere l'alto tasso di sopravvivenza e le caratteristiche naturali delle cellule neuronali e non neuronali dissociate il più possibile in condizioni in vitro. In questo articolo, dimostriamo un metodo per isolare i neuroni primari dal cervelletto del topo in via di sviluppo, collocandoli in un ambiente in vitro, stabilendo la loro crescita e monitorandone la fattibilità e la differenziazione per diverse settimane. Questo metodo è applicabile ai neuroni embrionali dissociati dal cervelletto tra i giorni embrionali 12-18.

Sulla base delle diverse date di nascita dei sottotipi neuronali nel cervelletto, le colture degli embrioni di topo E12-E18 hanno prodotto diversi tipi di cellule. I neuroni di grande proiezione, come i neuroni CN (E9-E12) e i PC (E10-E13), sono emersi all'inizio durante lo sviluppo del cerebellar. Nei topi, le cellule di granulosi e Golgi sorsero tra gli e13 e l'E18 e subirono divisioni terminali fino alla settimana postnatale 4.
Sostituire il vecchio mezzo I con il medio fresco II nei giorni...

Condurre esperimenti in vitro per riflettere le condizioni in vivo nel modo più adeguato possibile non è un compito facile. L'uso delle colture cellulari primarie è un passo importante verso la comprensione della biologia cellulare in un intero organismo. Il protocollo fornito descrive come crescere e coltivare neuroni cerebellari embrionali del topo.

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

La coltura primaria delle cellule neuronali è un sistema modello ideale per studiare i neuroni dissociati nella coltura in vitro. Il vantaggio di utilizzare questo metodo è essere in grado di mantenere le caratteristiche cellulari delle cellule dissociate, come meccanismi, funzioni e morfologia in condizioni in vitro per alcune settimane il più vicino possibile alle condizioni in vivo. Mettere i coperchi rotondi in una piastra da 24 po 'sotto l'armadio della biosicurezza.Aggiungere 90 microlitri di poli-L-ornitina su ogni slittamento di copertura. Chiudere il cappuccio e posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore di 37 gradi per due giorni. Preparare il terreno di coltura e il mezzo di semina e mantenerli a quattro gradi Celsius.Preparare la soluzione di tripina di lavoro in DMEM/F12 e mantenerla a quattro gradi. Posizionare il mezzo di coltura e il mezzo di semina nell'incubatore a 37 gradi. Togliere la piastra da 24 pozzi dall'incubatrice.Lavare il coperchio scivola tre volte con doppia acqua distillata. Lasciare asciugare completamente il coperchio per almeno due ore. Preparare tre piastre di Petri piene di PBS freddo, tre piastre di Petri piene di HBSS freddo e cinque piastre di Petri piene di mezzo di dissezione fredda sul ghiaccio.Asporta le corna uterine e lavatele in PBS freddo tre volte sul ghiaccio. Da qui tutti i passaggi dovrebbero essere eseguiti sul ghiaccio per ridurre al minimo i danni ai tessuti. Dopo l'ultima fase di lavaggio, separare i cuccioli dall'utero in HBSS e trasferirli nel mezzo di dissezione fredda.Nel mezzo di dissezione, decapitare i cuccioli con le forbici. Aprire il calvario dal foramen magnum al bordo inferiore della cavità orbitale. Usando un paio di forcep fini, rimuovere la base del cranio e rimuovere il cranio dal cervello.Rimuovere con cura le meningi del cervelletto partendo dalla superficie laterale del peduncolo cerebellare centrale e dei pons. Tagliare entrambi i peduncoli cerebellari e separare il cervelletto dal resto del cervello. Posizionare immediatamente la cerebella raccolta in un tubo conico sterile da 15 ml riempito con DMEM/F12 sul ghiaccio.Centrifugare il tubo a 1.000 g a quattro gradi per un minuto in DMEM/F12. Ripetere questa procedura tre volte, rimuovendo delicatamente il supernatante con una pipetta e sospendendo il pellet in DMEM/F12 fresco. Aggiungere due millilitri di tripina prerischiata e pipettare delicatamente per mescolarli insieme.Posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi per 12 minuti. Dopo l'incubazione, portare il tubo nell'armadio di sicurezza e aggiungere 10 ml di DMEM/F12 per inattivare la tripina. Centrifugare la miscela a 1.200 g per cinque minuti.Scartare il supernatante e resuspend in mezzo fresco seguito da centrifugazione tre volte. Pre-bagnare una pipetta di plastica sterile con DMEM/F2. Aggiungere 3,5 millilitri di soluzione di lavoro DNAsi allo stesso tubo.Triturare il tessuto con una pipetta più volte fino a quando il fluido raggiunge un colore lattinoso omogeneo. Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 freddo alla miscela e procedere alla centrifuga. Centrifugare il campione a 1.200 g a quattro gradi per cinque minuti.Rimuovere con cura il supernatante senza disturbare il pellet. Rimuovere il mezzo di semina dall'incubatore. Aggiungere 500 microlitri di mezzo di semina prebellico e mescolarlo bene utilizzando la pipetta.Contare le cellule usando un emocitometro. Diluire la sospensione cellulare con mezzo di semina a una densità di 500.000 cellule per millilitro. Aggiungere 90 microlitri della miscela ad ogni pozzo al centro del coperchio.Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi per tre o quattro ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura prebellico in ogni pozzo. Sostituire la piastra nell'incubatore a 37 gradi.Dopo sette giorni, sostituire il vecchio mezzo con un mezzo di coltura fresco II.Preparare una piastra separata da 24 porri con la corrispondente organizzazione numerica e aggiungere 100 microlitri di PFA 4% a ciascun pozzo. Dopo i giorni desiderati in coltura, rimuovere delicatamente i coperchi dai pozzi della piastra di coltura originale e posizionarli nei pozzi corrispondenti della piastra PFA descritti nel passaggio precedente. Aggiungere PFA ai pozzali per immergere completamente i coperchi.Mantenere la piastra PFA a quattro gradi per 30-120 minuti. Dopo l'incubazione, ripristinare la piastra a temperatura ambiente. Lavare il coperchio scivola delicatamente con PBS per cinque minuti tre volte.La figura due del testo mostra la coltura cellulare cerebellare a partire dall'E18. L'immunofluorescenza per la calbindina mostra i neuroni Purkinje con estensioni assonali di tre giorni in vitro. Da sette a 10 giorni in vitro, i processi dendritici sono evidenti.A 21 giorni sono presenti rami dendritici complessi. La figura tre del testo mostra le colture cellulari cerebellari a partire da vari giorni embrionali. il rilevamento dell'immunofluorescenza della calbindina mostra i neuroni Purkinje con assoni precoci solo dopo 18 giorni in vitro.Le culture neuronali purkinje iniziate da E14 ed E15 svilupperanno dendriti, ma mai così complesse come quelle che si sviluppano quando L'E18 è il punto di partenza. La figura quattro del testo mostra che diversi tipi di cellule si sviluppano dalle colture E18 dopo 21 giorni in vitro. L'immunofluorescenza verde calbindina mostra i neuroni purkinje.L'immunofluorescenza rossa per la parvalbumina in B e C mostra internanti inibitori. L'immunofluorescenza rossa per il canale di tensione del sodio in E e F mostra i neuroni granuli. Il presente protocollo è economico e facile da condurre.Alla fine di questo video, sarai in grado di raccogliere e coltura i neuroni cerebellari e risolverli ai DIV desiderati.

primary-culture-of-neurons-isolated-from-embryonic-mouse-cerebellum

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Qui vi presentiamo un metodo per isolare e cultura dei granuli cerebellari cellule progenitrici dei neuroni e neuroni granuli cerebellari da mouse postnatale.

Isolamento e la coltura di cellule post-Natal Neuron cerebellare granuli mouse progenitore e Neuroni

Forniamo un protocollo per la coltura di neuroni dell'ippocampo altamente purificato da cervelli dei topi prenatale senza l'uso di uno strato di cellule gliali alimentatore.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Questo video dimostra la tecnica per isolare e coltivare i neuroni dei granuli cerebellari primari del topo. Le cellule vengono trattate con un antimetabolita per eliminare le cellule gliali proliferanti e produrre una coltura pura di neuroni granulari cerebellari.

Isolamento e coltura dei neuroni dei granuli cerebellari primari di topo

Questo video dimostra l'isolamento e la coltivazione di cellule progenitrici neurali cerebellari dal cervelletto di un cucciolo di topo. I progenitori dei neuroni dei granuli cerebellari vengono isolati e purificati attraverso l'adesione differenziale, rimuovendo efficacemente gli astrociti. Questi progenitori in coltura si differenziano successivamente in neuroni granulari cerebellari.

Isolamento e coltura di progenitori di neuroni granulari cerebellari murini

Questo video mostra un metodo per isolare le cellule staminali dal cervelletto del topo postnatale e differenziarle in cellule neurali. Le cellule staminali della sospensione cellulare isolata vengono purificate utilizzando perle magnetiche rivestite di anticorpi e vengono coltivate per formare neurosfere. Le neurosfere vengono quindi mantenute in un mezzo di differenziazione per generare cellule neurali.

Isolamento di cellule staminali dal cervelletto di topo postnatale e differenziazione in cellule neurali

Questo video dimostra la generazione di un modello di lesione neuronale nei neuroni dei granuli cerebellari primari di topo. Delinea i passaggi coinvolti nell'induzione del danno neuronale utilizzando NMDA, un agonista del recettore dei neurotrasmettitori eccitatori, e glicina, un co-agonista. NMDA e glicina si legano a specifici recettori neuronali, causandone la sovrastimolazione e provocando un massiccio afflusso intracellulare di calcio, che porta al danno e alla morte delle cellule...

Modellazione del danno neuronale nei neuroni dei granuli cerebellari primari di topo

I neuroni dopaminergici svolgono un ruolo regolatore vitale nel cervello. La loro perdita è associata al morbo di Parkinson. In questo video, mostriamo come generare colture primarie di neuroni dopaminergici centrali da mesencefalo embrionale di topo. Tali colture sono utili per studiare l'estrema vulnerabilità di questi neuroni a vari stress.

Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Questo studio presenta una tecnica per l'isolamento dei neuroni da topi neonatali WT. Richiede l'attenta disezione del midollo spinale dal topo neonatale, seguita dalla separazione dei neuroni dal tessuto del midollo spinale attraverso la scissione meccanica ed enzimatica.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Questo protocollo presenta un modo unico di generare colture cellulari del sistema nervoso centrale da cervelli di topo embrionali del giorno 17 per la ricerca neuro(immuno)logica. Questo modello può essere analizzato utilizzando varie tecniche sperimentali, tra cui RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria a flusso.

Stabilire colture cellulari miste neuronali e gliali da cervelli di topo embrionali per studiare l'infezione e l'immunità innata

Questo protocollo descrive una co-coltura microglia-neuronale stabilita da cellule neuronali primarie isolate da embrioni di topo ai giorni embrionali 15-16 e microglia primaria generata dal cervello di topi neonatali nei giorni post-natali 1-2.

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Impara la coltura primaria di neuroni cerebellari da embrioni di topo per studiare lo sviluppo neuronale in vitro. Questo metodo consente di analizzare caratteristiche cellulari e funzioni in condizioni controllate.

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

Esplora altri video