Name: Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Scopri come misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus da parte dei leucociti umani utilizzando la citometria a flusso. Questo metodo permette di distinguere rapidamente la fagocitosi dall'adesione.

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Ringraziamo la signora Pia Stier per l'eccellente assistenza tecnica. M. von Lilienfeld-Toal è supportato dal Center for Sepsis Control and Care (Ministero federale tedesco dell'istruzione e della salute, BMBF, FK, FK, 01E01002) e dal campo di ricerca InfectoGnostics (BMBF, FK-13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang è supportato dalla Jena School of Microbial Communication (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FK 214/2)

Questo protocollo include l'uso di camici buffy umani ottenuti dall'Institute for Transfusion Medicine, jena University Hospital e sangue venoso fresco prelevato dai pazienti, sia dopo il consenso informato scritto dei donatori in conformità con l'approvazione del comitato etico 4357-03/15.
1. Preparazione di Aspergillus fumigatus Conidia
<ol><li>Coltivare A. fumigatus su 1,5% di malto agar Petri piatti per 5 giorni a 37 gradi centigradi senza CO2. A. fumigatus è un microrganismo di livello 2 di biosicurezza e deve essere maneggiato in una struttura appropriata utilizzando un armadio di biosicurezza e indossando camice da laboratorio, guanti e una maschera di filtro. NOTA: La piastra deve essere completamente ricoperta da uno strato di conidia verde-grigiastra. Le culture bianche non sporche. Composizione di malto agar: 4% (w/v) estratto di malto, estratto di lievito 0.4% (w/v), agar 1.5% (w/v), Aqua dest.</li>
	<li>Conidia di raccolta
	<ol>
<li>Mettere un tovagliolo di carta bagnato con disinfettante nell'armadio di biosicurezza e mettere la piastra sopra per evitare una distribuzione eccessiva di conidia volatile.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di fosfato tamponato salina (PBS) - 0.01% detergente sulla parte superiore del fungo, utilizzare una spatola Drigalski per stendere il liquido sopra la piastra e strofinare fuori la conidia di colore scuro. Fare attenzione a non rimuovere il micelio bianco.</li>
		<li>Mettere la sospensione della conidia in un tubo da 50 mL utilizzando un colino a cellule da 30 m per rimuovere qualsiasi micelio residuo.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.2.2 e 1.2.3 e raccogliere nello stesso tubo da 50 mL.</li>
		<li>Girare per 5 min a 2.600 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e risospendere in 20 mL di sterile Aqua dest.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di conidia con una camera di conteggio Thoma. N.B.:Il protocollo può essere messo in pausa qui e la sospensione conidia memorizzata per un massimo di 1 mese a 4 gradi centigradi con il coperchio avvitato strettamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Etichettatura FITC
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di 0,1 mM di polvere FITC in sterile 0,1 M Na2CO3 (disciolto in PBS). AGGIORNAMENTO: La polvere FITC è pericolosa e deve essere maneggiata con guanti, occhiali e una maschera di filtro. Raccogliere i rifiuti secondo le normative locali. NOTA: Omettere la luce artificiale durante questo e i seguenti passaggi che coinvolgono conidia.</li>
		<li>Risospendere 1 x 108 (o meno) conidia in 5 mL di soluzione FITC in un tubo da 15 mL. Incubare per 20 min a 37 gradi centigradi in un rotatore.</li>
		<li>Per il controllo negativo, risospendere la conidia in 0,1 M Na2CO3 (senza FITC) in un tubo da 15 mL. Incubare per 20 min a 37 gradi centigradi in un rotatore. NOTA: Nel calcolo della quantità di conidia da macchiare, tenere conto di una perdita fino al 70% durante la colorazione, il gonfiore e tutte le necessarie fasi di lavaggio. Se non è disponibile alcun rotatore, la sospensione deve essere scossa tre volte durante l'incubazione.</li>
		<li>Per il lavaggio, aggiungere 10 mL di PBS - 0,01% detergente alla sospensione e girare per 5 min a 2.600 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e ripetere il lavaggio due volte con 10 mL di detersivo PBS - 0,01%.</li>
	</ol></li>
	<li>Gonfiore della conidia (può essere omesso se non lo si desidera)
	<ol>
<li>Resospendi il FITC conidiato conidia in 5 mL del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio - 10% Siero di vitello fetale (FCS) e incuba reca in un rotatore a 37 gradi centigradi per il tempo desiderato (ad esempio, 2 h, 4 h). NOTA: Se non è disponibile alcun rotatore, la sospensione deve essere agitata almeno ogni 20 min durante l'incubazione.</li>
		<li>Aggiungete 10 mL di PBS - detergente allo 0,01% alla sospensione e girate per 5 min a 2.600 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e lavare due volte con 10 mL di detersivo pbS - 0,01%.</li>
		<li>Filtrare attraverso un colino a 30 m per rimuovere grandi ciuffi di conidia.</li>
	</ol></li>
	<li>Fissaggio di conidia (può essere omesso se non lo si desidera)
	<ol>
<li>Risospendere FITC etichettato e gonfio conidia in 1 mL di formaldeide e incubare per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungete 10 mL di PBS - detergente allo 0,01% alla sospensione e girate per 5 min a 2.600 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e lavare due volte con 10 mL di detersivo pbS - 0,01%. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui e la conidia memorizzata in PBS al buio (tubo avvolto in un foglio di alluminio) per un massimo di 1 settimana a 4 gradi centigradi.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione dei leucociti della Primaria Umana
<ol><li>Mettere 5 mL di cappotto di bufala in un tubo da 50 mL. In alternativa, utilizzare sangue venoso periferico umano fresco prelevato in monovette di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA) (10 mL per tubo 50 mL). PRUDENTE: Il sangue umano può trasmettere virus come il virus dell'immunodeficienza umana e il virus dell'epatite B. Maneggiare solo dopo essere stato vaccinato contro l'epatite B. Manico in un armadietto di biosicurezza indossando camice da laboratorio e guanti.</li>
	<li>Riempire il tubo con Erithrocyte Lysis (EL) Buffer, invertire tre volte e incubare per 5-8 min orizzontalmente fino a quando l'aspetto lattiginoso della miscela diventa chiaro. NOTA: Occasionalmente, il sangue può richiedere più tempo per la liscivia. Vai dal capre. Non è insolito che due tubi dello stesso sangue prendano tempi diversi per la lisce. Composizione del buffer EL: 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA</li>
	<li>Girare per 10 min a 300 x g a temperatura ambiente. Scartare il super-attardato.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 1 mL di EL Buffer mediante pipettaggio. Quindi aggiungere altri 24 mL di buffer EL e invertire più volte.</li>
	<li>Girare per 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare le cellule sovrnatali e risospendere nuovamente in 1 mL di RPMI - 10% FCS.</li>
	<li>Determinare la concentrazione cellulare con una camera di conteggio Neubauer.</li>
</ol>3. Saggio di fagocitosi
<ol><li>Incubare 2 x 106 leuciti e 4 x 106 conidia con etichettata FITC (molteplicità di infezione 2) in 1,5 mL di RPMI - 10% FCS in una piastra di coltura cellulare 12-well. Come controlli, includere solo le celle (senza conidia) e le celle, senza etichetta.</li>
	<li>Mettere in un'incubatrice di CO2 umidificata a 37 gradi centigradi e incubare per il periodo di tempo desiderato (ad esempio, 0,5 h, 2 h o 4 h).</li>
	<li>Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule con un raschietto cellulare e mettere in un tubo da 15 mL.</li>
	<li>Girare per 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Raccogliere supernatante per l'analisi citochina o scartare se non voluto. Risospendere ogni campione in 100 gradi l di PBS - 2 mM edTA.</li>
</ol>4. Colorazione anticorpale
<ol><li>Per ogni campione, preparate 100 luna di miscela di anticorpi, incluso l'anticorpo anti-FITC APC, secondo la tabella 1.</li>
	<li>Mettete un campione di 100 L in un pozzo di una piastra v-fondo da 96 pozze. Aggiungere 150 l di PBS e 2 mM di EDTA per il lavaggio.</li>
	<li>Per la compensazione del colore, posizionare 1 x 106 celle per ogni colore in ulteriori pozzi della piastra inferiore A 96-well V. Includere un pozzo di cellule che viene lasciato incontaminato. Aggiungere 150 l di PBS e 2 mM di EDTA per il lavaggio.</li>
	<li>Coprire la piastra con un foglio adesivo.</li>
	<li>Girare per 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Rimuovere la pellicola.</li>
	<li>Scartare il supernatante invertendo rapidamente e forzatamente la piastra solo una volta sopra il lavandino o un tovagliolo di carta usa e getta. NOTA: Non ripetere o battere la piastra su una carta fino a quando non si asciuga in quanto ciò comporterà una massiccia perdita di cellule dalla piastra.</li>
	<li>Risospendere le cellule nella miscela di anticorpi da 100 e mescolare bene con la pipettatura.</li>
	<li>Per la compensazione del colore, risospendere le rispettive cellule in 100 : L di PBS - 2 mM EDTA e aggiungere un singolo anticorpo ad ogni pozzo alla stessa quantità utilizzata nella miscela anticorpale.</li>
	<li>Coprire con un foglio adesivo e incubare per 20 min a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Rimuovere la pellicola. Aggiungete 150 l di PBS e 2 mM di EDTA a ciascun pozzo per il lavaggio. Coprire con un foglio adesivo.</li>
	<li>Girare per 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Rimuovere la pellicola. Scartare il supernatante invertendo rapidamente e forzatamente la piastra sopra il lavandino o un tovagliolo di carta usa e getta.</li>
	<li>Risospendere in 200 gradi di PBS - 2 mM di EDTA e trasferire le celle da ogni pozzo a un tubo inferiore rotondo separato. Assicurarsi che non siano presenti gruppi cellulari nella sospensione. Rimuovere i cluster in caso contrario. NOTA: Ogni ammasso abbastanza grande da far vedere all'occhio è abbastanza grande da intasare potenzialmente il citometro.</li>
</ol>5. Citometria di flusso
<ol><li>Avviare il citometro di flusso e lasciarlo riscaldare. Avviare il software di acquisizione.</li>
	<li>Creare un nuovo esperimento e impostare ed etichettare gli esempi.</li>
	<li>Impostare i parametri (FSC 250, SSC 250) e i rilevatori per i fluorofori FITC, APC, BUV395, V500, PerCP-Cy5.5.</li>
	<li>Impostazione retribuzione<ol>
<li>Aprire l'impostazione della retribuzione.</li>
		<li>Indicare i singoli colori.</li>
		<li>Utilizzando le celle di controllo lasciate instainate o con singole colorazioni, impostare le tensioni del rivelatore PMT in modo da includere tutti gli eventi all'interno della scala.</li>
		<li>Registrare almeno 10.000 eventi di ogni controllo.</li>
		<li>Utilizzare la configurazione retributiva per calcolare la fuoriuscita di fluorofori e applicare alle impostazioni del citometro dell'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registrazione dei dati di esempio<ol>
<li>Visualizzare FSC e SSC nel software di acquisizione e impostare cancello intorno leucociti.</li>
		<li>Basato sul cancello leukocito, visualizzare dot plot SSC/CD45 e cancello per le celle CD45 per separare dalla conidia.</li>
		<li>Visualizzare separatamente le celle CD45 in un grafico a punti CD14/CD66b e i monociti del cancello (CD14) e i neutrofili (CD66b).</li>
		<li>Visualizzare i neutrofili in un punto grafico anti-FITC/FITC.</li>
		<li>Utilizzando il campione con conidia non etichettata, impostare i quadranti per i segnali anti-FITC e FITC, consentendo un massimo dell'1% delle cellule nei rispettivi quadranti.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 5.5.4 e 5.5.5 per il cancello monocite.</li>
		<li>Registra tutti i campioni con almeno 20.000 eventi nel cancello del leucocito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), 113(2012).</li>
<li>Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+phagocytes+with+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interaction of phagocytes with filamentous fungi.</a> Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).</li>
<li>Heinekamp, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+Aspergillus+fumigatus+with+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Interference of Aspergillus fumigatus with the immune response.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (2), 141-152 (2015).</li>
<li>Slesiona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+versus+escape%3A+Aspergillus+terreus+and+Aspergillus+fumigatus+employ+different+strategies+during+interactions+with+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages.</a> PLoS One. 7 (2), 31223(2012).</li>
<li>Busetto, S., Trevisan, E., Patriarca, P., Menegazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step%2C+sensitive+flow+cytofluorometric+assay+for+the+simultaneous+assessment+of+membrane-bound+and+ingested+Candida+albicans+in+phagocytosing+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A single-step, sensitive flow cytofluorometric assay for the simultaneous assessment of membrane-bound and ingested Candida albicans in phagocytosing neutrophils.</a> Cytometry A. 58 (2), 201-206 (2004).</li>
<li>Lowe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+antimycobacterial+activity+and+phagocytosis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (2), 167-178 (2013).</li>
<li>Nuutila, J., Lilius, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitative+determination+of+ingestion+by+phagocytes+needs+the+distinguishing+of+overlapping+populations+of+binding+and+ingesting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitative determination of ingestion by phagocytes needs the distinguishing of overlapping populations of binding and ingesting cells.</a> Cytometry A. 65 (2), 93-102 (2005).</li>
<li>Saresella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+evaluation+of+phagocytosis+and+killing+of+Candida+albicans+by+CD13%2B+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid evaluation of phagocytosis and killing of Candida albicans by CD13+ leukocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 210 (2), 227-234 (1997).</li>
<li>Fattorossi, A., Nisini, R., Pizzolo, J. G., D'Amelio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New%2C+simple+flow+cytometry+technique+to+discriminate+between+internalized+and+membrane-bound+particles+in+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">New, simple flow cytometry technique to discriminate between internalized and membrane-bound particles in phagocytosis.</a> Cytometry. 10 (3), 320-325 (1989).</li>
<li>Heinzelmann, M., Gardner, S. A., Mercer-Jones, M., Roll, A. J., Polk, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+phagocytosis+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantification of phagocytosis in human neutrophils by flow cytometry.</a> Microbiology and Immunology. 43 (6), 505-512 (1999).</li>
<li>Perticarari, S., Presani, G., Mangiarotti, M. A., Banfi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+flow+cytometric+method+to+measure+phagocytosis+and+oxidative+products+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils.</a> Cytometry. 12 (7), 687-693 (1991).</li>
<li>Sveum, R. J., Chused, T. M., Frank, M. M., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+fluorescent+method+for+measurement+of+bacterial+adherence+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolological+Methods%22%5BJournal%5D)">A quantitative fluorescent method for measurement of bacterial adherence and phagocytosis.</a> Journal of Immunolological Methods. 90 (2), 257-264 (1986).</li>
<li>de Boer, E. C., Bevers, R. F., Kurth, K. H., Schamhart, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+fluorescent+flow+cytometric+assessment+of+bacterial+internalization+and+binding+by+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Double fluorescent flow cytometric assessment of bacterial internalization and binding by epithelial cells.</a> Cytometry. 25 (4), 381-387 (1996).</li>
<li>Hartung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+Quantitative+Evaluation+of+Human+Leukocyte+Interaction+with+Aspergillus+fumigatus+Conidia+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fast and Quantitative Evaluation of Human Leukocyte Interaction with Aspergillus fumigatus Conidia by Flow Cytometry.</a> Cytometry A. 95 (3), 332-338 (2019).</li>
<li>Fei, C., Lillico, D. M. E., Hall, B., Rieger, A. M., Stafford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connected+component+masking+accurately+identifies+the+ratio+of+phagocytosed+and+cell-bound+particles+in+individual+cells+by+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Connected component masking accurately identifies the ratio of phagocytosed and cell-bound particles in individual cells by imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 91 (4), 372-381 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo presenta un metodo citometrico a flusso rapido per misurare l'interazione di A. fumigatus conidia con un gran numero di leucociti umani primari che non è possibile nei protocolli microscopici comuni. L'imaging delle cellule con un microscopio e il conteggio manuale delle conidie interiorizzate sono ingombranti e possono realisticamente essere eseguite solo per alcune centinaia di cellule. La citometria di flusso supera questo problema misurando migliaia di cellule in pochi minuti. Un ostacolo c...

L'aspergillosi polmonare invasiva è una grande minaccia per i pazienti immunocompromessi in quanto le opzioni di trattamento sono limitate e hanno successo solo dopo la diagnosi precoce, il che porta ad alti tassi di mortalità1. Gli agenti infettivi sono conidia (spore) dello stampo Aspergillus fumigatus che sono onnipresenti per la maggior parte degli habitat2. I Conidia vengono inalati, passano attraverso le vie aeree e possono finalmente entrare negli alveoli polmonari. Negli esseri umani immunocompetenti, queste conidie vengono eliminate da cellule immunitarie innate come monociti o macrofagi e granulociti neutrofili, che assumono (fagocitosi) e digeriscono gli agenti patogeni3. La fagocitosi è importante per i microbiologi e gli immunologi allo stesso modo quando sono interessati alle interazioni ospite-patogeno. I saggi di confronto, come la co-incubazione di leucociti e conidi, spesso includono l'etichettatura delle spore da fluoresceina o dalla sua fluoresceina derivata isothiocyanate (FITC). Utilizzando un microscopio, è semplice identificare conidia fluorescente interiorizzata e determinare la conidia collegata / aderente, anche se questo approccio è ingombrante e realisticamente limitato a poche centinaia di cellule4. Tuttavia, nella citometria di flusso che consente facilmente l'analisi di centinaia di migliaia di cellule in pochi minuti, la colorazione differenziale di conidia fagocitosa e aderente è vitale. Pertanto, molti protocolli si basano su Trypan Blue per dissetare FITC-fluorescenza da aderente conidia5,6,7,8. Un altro approccio è lo sfruttamento del trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza di bromuro di etidio e FITC per emettere rosso invece di fluorescenza verde da aderente conidia9,10,11. Se sono disponibili anticorpi specifici, come nel caso di alcuni batteri, le particelle legate alle cellule possono essere macchiate direttamente12,13.
Qui, presentiamo un protocollo per valutare rapidamente e quantitativamente la fagocitosi di A. fumigatus conidia con ileuciti umani insieme all'attaccamento delle spore alle cellule e alla mancanza di interazione utilizzando un anticorpo anti-FITC accoppiato all'allocazione (APC). Il metodo consente anche l'analisi citometrica a flusso simultaneo di ulteriori marcatori cellulari che possono essere impiegati per l'analisi separata della fagocitosi da monociti e neutrofili dello stesso campione.
Il protocollo può essere applicato per la caratterizzazione dei ceppi fungini (ad esempio, diverse specie di Aspergillus e altri stampi del genere Mucorales qui presentati) e dei loro mutanti14 e ricerca immunologica sui fagociti, come i leucociti da individui immunocompromessi.

<table><tbody><tr><td>Pellicola adesiva</td><td>Marca</td><td>701367</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD14 V500</td><td>BD Biosciences</td><td>561391</td><td>clone M5E2</td></tr><tr><td>anti-CD45 BUV395</td><td>BD Biosciences</td><td>563792</td><td>clone HI30</td></tr><tr><td>anti-CD66b PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>562254</td><td>clone G10F5</td></tr><tr><td>anti-FITC APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-7691-82</td><td>clone NAWESLEE</td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari, 12 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Bioswisstech</td><td>800020</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare, 30 &; m</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-098-458</td><td>SmartStrainer</td></tr><tr><td>Citometro</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>LSR Fortessa II, laser: 488 nm (blu), 405 nm (viola), 355 nm (UV) e 640 nm (rosso)</td></tr><tr><td>Detergente</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Tween 20, 0,01% in PBS</td></tr><tr><td>Drigalski spatola</td><td>Carl Roth</td><td>PC59.1</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED3SS-500g</td><td>2 mM in PBS Tampone</td></tr><tr><td></td><td></td><td>per lisi eritrocitaria</td><td>0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>Biochrom AG</td><td>S 0115</td><td>10% in RPMI 1640</td></tr><tr><td>Isotiocianato di fluoresceina (FITC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3651-100MG</td><td>0,1 mM in soluzione Na2CO3 /PBS</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Carl Roth</td><td>PO87.3</td><td>Histofix</td></tr><tr><td>Malt agar ( 1,5%)</td><td></td><td></td><td>estratto di malto (40 g), estratto di lievito (4 g), agar (15 g), acqua dest. (1 L), regolare il pH a 5,7-6,0, sterilizzare a 121 &deg; C per 35 minuti</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Carl Roth</td><td>8563.1</td><td>0.1 M in piastra di Petri PBS</td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>189012-014</td><td>senza calcio, senza magnesio</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870010</td><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX</td></tr><tr><td>Supplement Rotator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-753</td><td>MACSmix Tube Rotator</td></tr><tr><td>Tubo a fondo tondo, 7,5 mL</td><td>Corning</td><td>REF 352008</td><td></td></tr><tr><td>Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSDiva 8.0</td></tr><tr><td>V-bottom plate, 96 pozzetti</td><td></td><td>Superficie di marca 781601</td><td>non trattata</td></tr></tbody></table>

misurare la fagocitosi di aspergillus fumigatus conidia da parte dei leucociti umani utilizzando flow cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

L'infezione polmonare invasiva da parte dello stampo Aspergillus fumigatus rappresenta una grande minaccia per i pazienti immunocompromessi. Le conidia fungine inalate (spore) vengono eliminate dagli alveoli polmonari umani per essere fagocitosed da monociti innati e/o neutrofili. Questo protocollo offre una misurazione rapida e affidabile della fagocitosi mediante citometria di flusso utilizzando conidia con etichettatura fitC (isotonionnate) con etichettatura fitC (FITC) per la co-incubazione con leucociti umani e la successiva controtendenza con un anticorpo anti-FITC per consentire la discriminazione dei conerentidi internalizzati e addicenti delle cellule. I principali vantaggi di questo protocollo sono la sua rapidità, la possibilità di combinare l'analisi con l'analisi citometrica di altri marcatori cellulari di interesse, l'analisi simultanea di monociti e neutrofili da un singolo campione e la sua applicabilità ad altri funghi o batteri che portano la parete cellulare. La determinazione delle percentuali di fagocitosi sui leucociti fornisce un mezzo ai microbiologi per valutare la virulenza di un agente patogeno o per confrontare patogeni tipi selvatici e mutanti, nonché con gli immunologi per studiare le capacità di leucociti umani per combattere gli agenti patogeni.

Nella misurazione della fagocitosi di A. fumigatus conidia da cellule fagocitiche umane, la discriminazione tra l'autentica internalizzazione e il semplice attaccamento di conidia alle cellule è un ostacolo, soprattutto quando si tratta di metodi ad alto throughput come la citometria di flusso. Al fine di superare questo ostacolo, presentiamo un protocollo veloce e affidabile basato sulla colorazione della conidia con la tintura fluorescente FITC prima della co-incubazione di cellule e conidia, seguita da una co...

Questo protocollo fornisce un metodo veloce e affidabile per misurare quantitativamente la fagocitosi di Aspergillus fumigatus conidia da fagociti primari umani utilizzando la citometria di flusso e per discriminare la fagocitosi di conidia dalla mera adesione ai leucociti.

Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Questo protocollo è significativo perché misura quantitativamente la fagocitosi dei fumigatori aspergillus etichettati Conidia dai leucociti umani, insieme all'attaccamento di Conidia alle cellule e alla mancanza di interazione per citometria del flusso. Il vantaggio principale di questo metodo è che facilita l'analisi rapida di un gran numero di cellule. Inoltre, l'etichettatura dei marcatori cellulari consente di separare la valutazione di neutrofili e monociti all'interno dello stesso campione.In qualsiasi questa tecnica può essere utilizzato per analizzare altri funghi clinici rilevanti come Mucorales. Invece i globuli rossi potrebbero essere usati come fagociti. Per iniziare questa procedura, bagnare un tovagliolo di carta con disinfettante e posizionarlo in un armadietto di sicurezza bio.Posizionare un piatto di Aspergillus fumigatus coltivato sopra l'assorbente di carta per evitare un'iperdistribuzione della Conidia volatile. Aggiungere 10 millilitri di PBS contenenti lo 0,01% di detersivo sopra il fungo e utilizzare una spatola Drigalski per stendere il liquido sul piatto e strofinare la Conidia di colore scuro. Trasferire la sospensione Conidia su un colino da 50 millilitri attraverso un colino da 30 micrometri, che rimuoverà eventuali mielie residue.Aggiungere altri 10 millilitri di PBS con detersivo alla piastra, stenderlo con una spatola e trasferirlo nello stesso tubo attraverso il colino. Successivamente, preparare una soluzione sterile di carbonato di sodio molare 0,1, sciolto in PBS. E preparare una soluzione millimolare da 0,1 millimolare di polvere FITC, in questa soluzione di carbonato di sodio.Sospendere di nuovo 100 milioni o meno di Conidia, in cinque millilitri di questa soluzione FITC, in un tubo da 15 millilitri. Incubare in un rotatore a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Per gonfiarsi a Conidia, resuspend il FITC etichettato Conidia in cinque millilitri di mezzo RPMI, integrato con 10%FCS.E incubare in un rotatore a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato. In un armadietto di sicurezza bio, posizionare cinque millilitri di buffy coat in un tubo da 50 millilitri. Riempire il tubo con il buffer EL e invertire tre volte.Incubare orizzontalmente per cinque o otto minuti, fino a quando l'aspetto lattiero della miscela diventa chiaro. Quindi, centrifugare a 300 volte G e a temperatura ambiente per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitri di el buffer mediante pipettazione.Aggiungere altri 24 millilitri di tampone EL e invertire il tubo più volte. Centrifuga a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitri di supporti RPMI, integrati con il 10%FCS.Per iniziare, trasferisci due milioni di leucociti e quattro milioni di Conidia con etichetta FITC in 1,5 millilitri di RPMI integrati con FCS al 10%, su una piastra di coltura da 12 pozzi. Includere un controllo delle celle solo senza Conidia e un controllo delle celle con Conidia senza etichetta. Incubare la piastra in un incubatore di anidride carbonica umidificato, a 37 gradi Celsius per la quantità di tempo desiderata.Quando l'incubazione è completa, utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere le cellule e trasferirle in un tubo da 15 millilitri. In primo luogo, mettere 100 microlitri di ogni campione e controlli in un unico pozzo di una piastra inferiore a V da 96 po '. Aggiungere 150 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA per il lavaggio.Per la compensazione del colore, posizionare un milione di celle senza Conidia per ogni colore, in altri pozzi della piastra. Includere un pozzo di celle che verranno lasciate senza tensione. Aggiungere 150 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA ad ogni pozzo per il lavaggio.Quindi, coprire la piastra con un foglio adesivo e centrifugare a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, rimuovere il foglio e scartare il supernatante invertendo rapidamente e con forza la piastra solo una volta sopra il lavandino o un tovagliolo di carta usa e getta. Rimospendare le cellule in 100 microlitri di miscela di anticorpi e mescolare bene con la pipettazione.Per le compensazioni di colore, resuspend le rispettive cellule in 100 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA, e aggiungere un singolo tipo di anticorpo a ciascun pozzo, alla stessa quantità utilizzata nella miscela di anticorpi. Coprire con un foglio adesivo e incubare a temperatura ambiente al buio per 20 minuti. Successivamente, rimuovere il foglio e aggiungere 150 microlitri di PBS contenenti due millimolari di EDTA ad ogni pozzo per il lavaggio.Coprire di nuovo la piastra con un foglio adesivo. Centrifuga a 300 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi rimuovere il foglio e scartare il supernatante invertendo rapidamente e con forza la piastra su un lavandino o un tovagliolo di carta usa e getta.Rimorsipare le cellule in 200 microlitri di PBS contenenti EDTA millimolare e trasferire la sospensione cellulare da ogni pozzo, in un tubo inferiore rotondo separato. Avviare il citometro di flusso e lasciarlo riscaldare. Nel software di acquisizione, creare un nuovo esperimento e impostare ed etichettare i nuovi campioni.Impostare i parametri e i rilevatori per i fluorofori appropriati, come indicato nel protocollo di testo. In questo software, visualizzare i grafici a punti appropriati come delineato nel protocollo di testo. Usando le cellule solo campione, acquisire alcune cellule e impostare il cancello intorno ai leucociti.Basato sul cancello del leucocita, gate per le cellule positive cd45, da separare da Conidia nella trama cd45 della SSC. In un grafico a punti, CD14, CD66b, neutrofili di gate e monociti separatamente. Successivamente, passare dall'unico campione di celle a Conidia senza etichetta.In un grafico a punti, anti-FITC, APC FITC, visualizzare i neutrofili nei quadranti impostati per i segnali anti-FITC e FITC. Aprire la visualizzazione statistiche e regolare i quadranti, consentendo un massimo dell'1% delle celle nei quadranti Q1, Q2 e Q4. Ripetere questo processo per il cancello monocitare. Nel cancello del leucocita, registrare tutti i campioni con almeno 20.000 eventi.La fagocitosi della Conidia etichettata FITC dai neutrofili umani può essere letta dalle viste statistiche. In questo studio, un metodo citometrico a flusso rapido viene utilizzato per misurare l'interazione dei fumigatori di Aspergillus Conidia con un gran numero di leucociti umani primari. Utilizzando gli anticorpi appropriati e la strategia di gating qui mostrata, una gating generale di leucociti umani per caratteristiche FSC e SSC, è seguita da una separazione dei leucociti in conidia libera, dal marcatore pan leucocitare, CD45.Conidia può raggiungere quasi le dimensioni delle cellule al momento della citometria del flusso, specialmente quando si utilizza Conidia gonfia, e o lunghi tempi di incubazione, e quindi può comprarci l'analisi. Poiché i monociti primari umani e i neutrofili prendono Conidia in modo diverso, questo protocollo consente l'analisi separata di queste popolazioni cellulari in base alla colorazione con i marcatori di lignaggio cellulare ben consolidati, CD14 per i monociti e CD66b per i neutrofili. La percentuale di fagociti primari umani che interiorizzano la Conidia può essere altamente variabile tra i donatori di sangue, ma dipende anche da fattori sperimentali, come il tempo di incubazione e lo stato di gonfiore della Conidia.L'internalizzazione delle spore può essere rilevata dopo 0,5 ore di co-incubazione e aumenta con il tempo. La Conidia pre-gonfia viene assunta più facilmente rispetto alle spore a riposo, anche in brevi tempi di incubazione. Se la Conidia è fissata con formaldeide, la fagocitosi viene diminuita rispetto alla conidia nativa.Seguendo questa procedura, i supernanti delle cellule immunitarie co-incubate e della Conidia possono essere raccolti e analizzati da Eliza per verificare se l'interazione provoca un rilascio di citochine da parte delle cellule immunitarie. Ricorda, il sangue umano può potenzialmente trasmettere malattie infettive. Questo lavoro richiede la vaccinazione attraverso l'epatite B, l'uso di un armadietto di sicurezza bio, oltre a indossare guanti su un camice da laboratorio.

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Immunologia e Infezioni

Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l'osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

Questo video dimostra un metodo per quantificare la fagocitosi delle spore fungine patogene marcate con FITC da parte dei leucociti umani. Le spore fagocitate vengono distinte dalle spore aderenti alle cellule attraverso la controcolorazione, seguita dall'analisi citofluorimetrica.

Misurazione citofluorimetrica quantitativa della fagocitosi delle spore fungine da parte dei fagociti umani

Questo video mostra un test di fagocitosi basato sulla citometria a flusso che coinvolge eritrociti infettati da Plasmodium falciparum marcati e opsonizzati da monociti. La citometria a flusso identifica la fluorescenza nei monociti, confermando il successo dell'identificazione degli eritrociti opsonizzati attraverso la fagocitosi.

Un test per quantificare la fagocitosi mediata da anticorpi di eritrociti infetti da parassiti

Questo video mostra l'imaging di cellule vive per l'analisi dell'attività antifungina nei neutrofili umani utilizzando conidi reporter fluorescenti di Aspergillus. Inizialmente, sia la fluorescenza rossa che quella magenta sono rilevate all'interno dei neutrofili, mentre la fluorescenza rossa diminuisce nel tempo, indicando la degradazione dei conidi e confermando l'attività antifungina dei neutrofili.

Valutazione in tempo reale dell'attività antifungina delle cellule immunitarie umane primarie

Qui mostriamo come citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti in coltura. Questa tecnica può essere utilizzata come alternativa al CFU enumerazione.

L&#39;uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

Un metodo per valutare la capacità di isolato macrofagi alveolari del mouse per controllare la crescita di spore di Aspergillus fagocitati mediante microscopia confocale.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

Qui, descriviamo un protocollo per valutare l'attività antifungina di cellule immunitarie umane primarie in tempo reale utilizzando fluorescente Aspergillus conidi giornalista in combinazione con microscopia video live-cell e citometria a flusso. Dati generati forniscono informazioni sulle interazioni di accoglienza cellulo Aspergillus, come fungicida, fagocitosi, la migrazione delle cellule e l'inibizione della crescita di funghi.

Immagini dal vivo di antifungini attività da Human neutrofili e monociti primaria in risposta a<em&gt; A. fumigatus</em

Qui descriviamo un protocollo per determinare l'onere fungine polmonari nei topi con aspergillosi invasiva mediante la quantificazione di argento methanamine modificate di Gomori colorazione nelle sezioni istologiche. Utilizzo di questo metodo ha provocato risultati comparabili con meno animali rispetto alla valutazione dell'onere fungine mediante PCR quantitativa di DNA fungoso del polmone.

Istologico quantificazione per determinare il fardello fungine del polmone nell'aspergillosi sperimentale

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire istruzioni su come misurare la capacità degli anticorpi presenti nella sera o nel plasma degli individui, naturalmente esposti all'infezione da Plasmodium falciparum, di opsonizzare e indurre la fagonitosi degli etriciti infettati da parassiti (IE).

Misurazione di anticorpi che inducono la fagonenza acquisita naturalmente ai parassiti Plasmodium falciparum mediante un'analisi basata sulla citometria del flusso

Descriviamo il metodo per l'analisi quantitativa della distribuzione di Aspergillus fumigatus conidia (3 μm di dimensione) nelle vie aeree dei topi. Il metodo può anche essere utilizzato per l'analisi della distribuzione di microparticelle e agglomerato di nanoparticelle nelle vie aeree in vari modelli di condizioni patologiche.

Analisi quantitativa basata su microscopia a scansione laser confocale della distribuzione di conidi di Aspergillus fumigatus nel polmone di topo a montaggio intero otticamente cancellato

La tecnica che prevede la fagocitosi dei conidi fungini da parte dei macrofagi è ampiamente utilizzata per gli studi che valutano la modulazione delle risposte immunitarie nei confronti dei funghi. Lo scopo di questo manoscritto è quello di presentare un metodo per valutare la fagocitosi e le capacità di clearance dei macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano stimolati con Trichoderma stromaticum conidia.

Saggio di vitalità dei conidi di Trichoderma stromaticum all'interno di macrofagi di derivazione mononucleare del sangue periferico umano

Scopri come misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus da parte dei leucociti umani utilizzando la citometria a flusso. Questo metodo permette di distinguere rapidamente la fagocitosi dall'adesione.

Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry

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