Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

Poiché diverse topologie di catene di ubiquitina hanno un'ampia gamma di effetti biologici, la comprensione dei cambiamenti nella loro abbondanza è rilevante per un'ampia varietà di stati biologici. L'applicazione del monitoraggio delle reazioni parallele all'analisi della catena dell'ubiquitina consente l'identificazione e la quantificazione specifica delle topologie della catena dell'ubiquitina. A differenza dei tipici esperimenti PRM, l'analisi della topologia della catena dell'ubiquitina è limitata a specifici peptidi modificati, molti dei quali non sono ideali per l'analisi della MS.

La dimostrazione visiva di questa tecnica evidenzia gli aggiustamenti e i risultati attesi osservati per questi peptidi non ideali. Inizia preparando una soluzione di bicarbonato di ammonio, una soluzione di n-etilmaleimmide e un tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina come descritto nel manoscritto del testo. Risospendere il campione biologico nel tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina e lisare le cellule con un metodo appropriato.

Dopo la lisi cellulare, centrifugare il campione a 18.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca a basso contenuto proteico. Se necessario, conservare i campioni a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius prima di procedere. Per scongelare i campioni, mescolarli rapidamente con un ThermoMixer e non utilizzare temperature superiori a 50 gradi Celsius.

Una volta scongelati, centrifugare i campioni a 18.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire 20 microgrammi in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame, quindi regolare il volume a 50 microlitri con tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina. Preparare un controllo negativo con un volume normalizzato di tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina e un controllo positivo con il tampone e i tipi di catena disponibili in commercio. Preparare una soluzione di bicarbonato di ammonio 50 millimolare in acqua e regolare il pH a otto con un idrossido di sodio molare.

Pellettare una coltura di E.coli mediante centrifugazione a 5.000 volte G per cinque minuti. Lavare le cellule due volte con PBS e risospenderle in un tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina a cinque microgrammi per millilitro. Aggiungere un microgrammo di lisato di E.coli a ciascun campione e controllare.

Quindi preparare 500 millimolari di TCEP in acqua di grado MS e aggiungerlo a ciascun campione fino a una concentrazione finale di 50 millimolari. Agitare brevemente i campioni e incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, preparare una soluzione di cloroacetaldeide da 500 millimolari e bicarbonato di ammonio e aggiungerla ai campioni e controllare fino a una concentrazione finale di 55 millimolari.

Agitare brevemente i campioni e incubarli al buio per 20 minuti. Aggiungere l'endopeptidasi Lys-C ai campioni e incubarli a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo l'incubazione, diluire i campioni con 200 microlitri di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari, aggiungere tripsina e incubarli per altre 12 ore.

Il giorno successivo, aggiungere una soluzione di acido formico al 10% a ciascun campione e controllare con un rapporto volume/volume di 1:10. Verificare che il pH sia inferiore a tre. Quindi aggiungere 0,5 microlitri di peptide pesante standard a ciascun campione.

Dopo la pulizia standard del campione di C18, procedere con l'analisi di spettrometria di massa dei campioni con una metodologia basata su PRM. Per esportare l'elenco di isolamento, selezionare l'elenco di isolamento dal menu di esportazione, selezionare il tipo di strumento e impostare il metodo su standard. Fare clic su OK per aprire una richiesta di salvataggio di un file CSV che può essere utilizzato per creare un metodo PRM.

Quindi, importare l'esecuzione della pianificazione selezionando File, Importa e Risultati. Scegli più file da importare contemporaneamente e fai clic su OK, quindi seleziona i file e attendi il completamento dell'importazione. Quando si è pronti, rivedere le identificazioni facendo clic sulla massa per ogni ingresso di peptide pesante.

Il corretto riconoscimento del picco viene spesso determinato automaticamente, ma potrebbe essere necessaria una cura manuale. I tempi di ritenzione selezionati per le varianti pesanti vengono applicati anche alle versioni leggere, creando una schedulazione per il PRM. Per modificare la finestra di programmazione, selezionare il picco e fare clic su Impostazioni e Impostazioni peptidi.

Quindi modifica l'intervallo di tempo nella scheda Previsione. L'elenco di inclusione della pianificazione può quindi essere esportato utilizzando File, Esporta ed Elenco di isolamento. Scegliere il tipo di strumento appropriato, impostare il tipo di metodo su programmato e fare clic su OK.To analizzare i dati, importare tutti i campioni ed eseguire la cura, rimuovendo le transizioni con interferenze o scarsi rapporti segnale/rumore, quindi esportare i dati facendo clic con il pulsante destro del mouse sui grafici pertinenti e selezionando Copia dati o facendo clic su File, Esporta e Report.

Il trattamento con l'inibitore del proteasoma MG-132 previene la degradazione delle proteine coniugate dell'ubiquitina, che si traduce in un aumento della catena K48 nella linea cellulare di melanoma di topo B16, così come nelle due linee cellulari umane, A549 e HeLa. Il monitoraggio delle reazioni parallele o PRM esegue una scansione ionica completa del prodotto dopo la selezione dello ione precursore, il che significa che gli ioni del prodotto devono essere curati dopo l'esecuzione. Il cromatogramma per K48 è mostrato prima e dopo la polimerizzazione.

Sono stati rimossi gli ioni prodotti che hanno un segnale con un profilo di eluizione incoerente e bassa intensità. La transizione selezionata durante la cura dovrebbe essere coerente tra gli esperimenti, ma può differire a seconda delle condizioni cromatografiche, delle impostazioni di analisi e del background biologico del campione. Qui sono mostrati i cromatogrammi ionici tipici per ciascuna delle topologie di catena dell'ubiquitina identificate in questo esperimento.

Quando si progetta un esperimento PRM, l'energia di collisione può essere ottimizzata per migliorare il segnale. Quando sono state applicate energie di collisione da 14 a 28, si è scoperto che un'energia di collisione più alta di 26 era ottimale per K63, mentre un'energia più bassa di 18 era ideale per M1. Sono state trovate energie di collisione favorevoli per i peptidi caratteristici della topologia in questo esperimento e per una selezione di frammenti di ubiquitina non modificati, ma potrebbe essere necessario ottimizzarle in base allo spettrometro di massa e al metodo di frammentazione utilizzato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che per l'analisi della catena dell'ubiquitina, è necessario creare un equilibrio di condizioni per garantire che i collegamenti della catena dell'ubiquitina siano mantenuti, promuovendo al contempo la loro digestione in peptidi.

Questo metodo è vitale per la comprensione della segnalazione dell'ubiquitina in quanto fornisce una quantificazione accurata della topologia della catena dell'ubiquitina. Potrebbe essere combinato con un pull-down o un frazionamento degli organelli per risolvere il problema della topologia della catena dell'ubiquitina associata al campione proteico mirato.