Name: Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Scopri l'analisi delle topologie della catena ubiquitina mediante monitoraggio parallelo della reazione (PRM) per proteomica mirata. Questo metodo consente l'identificazione e la quantificazione specifica dei cambiamenti di abbondanza nelle catene ubiquitina.

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Gli autori ringraziano Céline Jeanty per la sua assistenza nella creazione di pellet cellulari con trattamento di MG-132 come descritto nei risultati rappresentativi e Elise Mommaerts per la sua fornitura di pellet E. coli utilizzati nel protocollo.

1. Preparazione di uno standard peptidico pesante
<ol><li>A seconda del fornitore e della qualità dei peptidi pesanti acquistati, i peptidi pesanti dovranno essere diluiti. Questo protocollo utilizzava le sequenze peptidiche riportate nella tabella 1, con l'amminoacido C-terminale modificato in lisina(13C615N2-lisina) o arginina (13C615N4-arginina).<ol>
<li>Mescolare i peptidi pesanti, diluire il mix con acetonitrile al 50% (ACN) per creare un mix peptidico con ogni peptide a 10 μM.</li>
		<li>Creare aliquote del mix peptidico e conservare a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione del campione
<ol><li>Lisi campione NOTA: La stabilità delle catene di ubiquitina deve essere considerata durante la preparazione del campione. Conservare i campioni biologici e i tamponi refrigerati a 4 °C e aggiungere campioni al tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina il più rapidamente possibile.<ol>
<li>Preparare una soluzione di 1 M NH4HCO3 (bicarbonato di ammonio) in acqua e regolare il pH a 8 utilizzando 1 M NaOH.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 200 mM N-etilmaleimide (NEM) in acqua.</li>
		<li>Preparare il buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina utilizzando 8 M urea in 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. NOTA: Una soluzione da 5 mL di urea da 8 M richiederà considerevolmente meno di 5 mL di acqua data l'espansione dell'acqua quando si è in una soluzione satura con urea. ATTENZIONE: Non preparare il tampone sopra i 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature.</li>
		<li>Resuspend il campione biologico da esaminare in tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina con l'obiettivo di 0,5 μg/μL di proteine e di leccare le cellule con un metodo appropriato per il campione. Un metodo di sonicazione composto da tre impulsi da 10 s con un sonificatore SFX 150 Branson impostato al 70% di intensità con 10 s di pause sul ghiaccio tra ogni impulso, è stato utilizzato per le linee cellulari in questo protocollo.</li>
		<li>Campione di centrifuga a 18.000 x g per 10 min a 4 °C in una centrifuga da tavolo.</li>
		<li>Trasferire il supernatante in un tubo di microcentrifugo fresco a basso legame proteico. I campioni possono essere conservati a -20 °C a questo punto, se necessario.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del campione e dei controlli
	<ol>
<li>Se i campioni sono congelati, mescolare (ad esempio, con un termomixer) mentre vengono scongelati per sciogliere rapidamente l'urea. ATTENZIONE: Non utilizzare temperature superiori a 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature.</li>
		<li>Campione di centrifuga a 18.000 x g per 10 min a 4 °C in una centrifuga da tavolo.</li>
		<li>Trasferire 20 μg di campione in un nuovo tubo di microcentrifugo a bassa lega e regolare il volume a 50 μL con tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina.</li>
		<li>Creare un controllo negativo utilizzando un volume normalizzato di buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina (50 μL). In questo campione non deve essere presente alcuna versione leggera di ciascun peptide, consentendo l'osservazione di qualsiasi contaminazione leggera derivante dai peptidi pesanti a spillo. Questo controllo negativo è stato utilizzato anche per la pianificazione del tempo di conservazione del PRM descritto nella sezione 3.1.</li>
		<li>È stato anche creato un controllo positivo con buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina e l'aggiunta di tipi di catena disponibili in commercio al volume normalizzato di buffer di stabilizzazione dell'ubiquitina (50 μL). Comunemente, K63, K48 e M1 sono disponibili. Nei risultati rappresentativi sono stati utilizzati 20 ng di K48, K63 e M1.</li>
	</ol></li>
	<li>Riduzione, alchilazione e digestione
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di bicarbonato di ammonio da 50 mM (NH4HCO3) in acqua e regolare il campione in pH = 8 con 1 M NaOH.</li>
		<li>Una coltura di E. coli coltivata in brodo LB è stata centrifugata 5.000 x g per 5 minuti per formare un pellet, che è stato poi lavato 2 volte con PBS prima della resuspensione in tampone di stabilizzazione ubiquitina a 5 μg/μL.</li>
		<li>Aggiungere 1 μg di E. coli lysate a ciascun campione e controllare. Questo protocollo utilizza E. coli (DH10B), ma è possibile utilizzare qualsiasi lisato complesso senza ubiquitina. Si noti che l'ubiquitina è comune a tutti gli eucarioti. NOTA: L'uso di una matrice di lisato E. coli riduce la perdita di peptidi a causa dell'adesione non specifica alle stoviglie. Ciò è particolarmente evidente nel controllo negativo o nei campioni con un contenuto proteico limitato e ha un forte impatto sull'osservazione di K6312.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 500 mM tris(2-carbossietile)fosfina (TCEP) in acqua di grado MS (DTT può essere utilizzato come alternativa).</li>
		<li>Ridurre i campioni e i controlli con l'aggiunta di TCEP a una concentrazione finale di 50 mM. Vortice brevemente prima di incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Se si utilizza DTT, la temperatura deve essere elevata a 50 °C. ATTENZIONE: Non utilizzare temperature superiori a 50 °C a causa della tendenza dell'urea a formare poliurea ad alte temperature.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 550 mM di cloroacetamide (CAA) in NH4HCO3. Conservare al buio.</li>
		<li>Alchilato i campioni e i controlli aggiungendo CAA ad una concentrazione finale di 55 mM. Vortice brevemente prima di incubare per 20 minuti a RT al buio. NOTA: CAA viene utilizzato al posto dell'iodoacetamide come agente di riduzione per ridurre la possibilità di una doppia modifica carbamidometile (114.0429) su un residuo di lisina scambiato per una modifica -GG (114.0429)13.</li>
		<li>Aggiungere l'endopeptidasi LysC ai campioni con un rapporto 1:25 (w/w) con il contenuto proteico. Incubare per 3 ore a 37 °C.</li>
		<li>Diluire i campioni e i comandi con 200 μL di 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).</li>
		<li>Aggiungere la tripsidena ai campioni con un rapporto di 1:25 w/w con il contenuto proteico. Incubare per 12 ore a 37 °C.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di acido formico (FA) al 10% in acqua di grado MS con un rapporto 1:10 v/v a ciascun campione e campione di controllo. Verificare che il pH sia <3) prima della pulizia C18 e aggiungere altro acido formico, se necessario.</li>
		<li>Ad ogni campione e controllo aggiungere 0,5 μL dello standard peptidico pesante creato nella sezione 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulizia peptidica
	<ol>
<li>Diversi produttori offrono punte o piastre di pulizia C18. Seguire le istruzioni del produttore per il prodotto utilizzato e i peptidi elusi secchi in una centrifuga sottovuoto, pronti per l'analisi ms.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi di LC-MS/MS
<ol><li>Esegui l'analisi PRM iniziale sullo standard peptidico pesante in modo non programmato.<ol>
<li>Resuspend i campioni essiccati in 10 μL di tampone di carico MS 2% ACN/0,05% acido trifluoroacetico (TFA).</li>
		<li>Equipaggia un HPLC con una colonna analitica C18 in fase inversa (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 perline) progettata per il nanoflusso MS. Una colonna trappola sacrificale (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 perline) per preservare la vita della colonna analitica è stata utilizzata qui ma non è richiesta.</li>
		<li>Accoppiare l'output della colonna analitica a una sorgente nano-ESI su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.</li>
		<li>Utilizzare un metodo di proteomica mirato appropriato per lo spettrometro di massa. Ad esempio, su un Q-Exactive più un metodo a due esperimenti, scorrere tra un full MS e un esperimento PRM. Per l'esperimento Full MS è stata utilizzata una risoluzione di 120.000 con un obiettivo AGC di 1e6 e 240 ms come IT massimo. Per l'esperimento PRM, lo stesso obiettivo AGC e l'IT massimo sono stati utilizzati con una risoluzione inferiore di 60.000 e una finestra di isolamento di 1,2 m/z.</li>
		<li>Iniettare 200 ng del controllo negativo sulla colonna analitica utilizzando l'autocampionatore HPLC. Applicare un gradiente lineare al campione sulla colonna analitica aumentando la concentrazione di ACN dal 2 al 25% in un periodo di ~45 min. NOTA: La concentrazione di ACN del 25% è inferiore al solito per la proteomica a causa della bassa natura idrofila dei tipici peptidi caratteristici della topologia dell'ubiquitina. Se altri peptidi devono essere quantificati, si può desiderare una maggiore concentrazione di ACN per ottenere una buona separazione del bersaglio.</li>
		<li>Analizzare i risultati dell'esecuzione della programmazione come descritto nella sezione 4.2 per creare un elenco di inclusione pianificato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi dei campioni<ol>
<li>Eseguire gli esempi rimanenti come descritto per la programmazione in 3.1 a parte l'utilizzo dell'elenco di inclusione pianificato creato nella sezione 4.2. NOTA: un vuoto deve essere eseguito dopo il controllo positivo per garantire che non venga rilevato alcun riporto dall'esecuzione precedente nei campioni successivi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analisi del software
<ol><li>Creare un elenco di inclusione della formattazione appropriata per l'MS utilizzato. Questo protocollo utilizzava il software open source Skyline (versione 19.1.0.193) (https://skyline.ms), che offre supporto e aiuto ben documentati. È possibile creare un elenco di inclusione per diversi spettrometri di massa utilizzando la struttura dell'elenco di isolamento delle esportazioni.<ol>
<li>Aprire un nuovo documento Skyline.</li>
		<li>Selezionare modifiche isotopiche pesanti in base alle esigenze dei peptidi caratteristici della topologia pesante. In Impostazioni| Impostazioni peptidice nella scheda Modifica fare clic sul campo nome per visualizzare la potenziale modifica. La selezione si basa sullo stato isotopico dei peptidi pesanti acquistati. In questo esempio sono stati utilizzati peptidi sintetici che trasportano una lisina pesante (13C615N2-lisina) o un'arginina pesante(13C615N4-arginina) al C-terminale. Le etichette appropriate sarebbero: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" e "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".</li>
		<li>Selezionare Impostazioni| Transizione. Nella scheda Filtro sono includono Precursor Charges 2, 3, 4.</li>
		<li>Inserire peptidi selezionando Modifica| Inserisci| Peptidi.</li>
		<li>Compilare i campi rilevanti, inclusa la sequenza peptidica caratteristica della topologia e un nome proteico (ad esempio, "Catena-K63").</li>
		<li>Espandete ogni peptide ora mostrato nel pannello Bersagli. Eliminare gli stati di addebito indesiderati. Lo stato di carica preferito e l'energia di collisione, che possono differire in base allo spettrometro di massa utilizzato, per ogni peptide caratteristico della topologia è mostrato nella tabella 1.</li>
		<li>Per ogni peptide caratteristico della topologia (ad eccezione di M1 in cui il GG è incluso nella sequenza), fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza e scegliere Modifica. Aggiungere un GG come modifica strutturale facendo clic sul campo nome e selezionando <Mostra tutto... > prima di selezionare "GlyGly (K)".</li>
		<li>Esportare l'elenco di isolamento File| Esporta| Elenco diisolamento , selezionare il tipo di strumento e impostare il tipo di metodo su Standard. Selezionando OK verrà aperto un prompt per salvare un file *.csv che può essere utilizzato per creare un metodo PRM.</li>
	</ol></li>
	<li>Crea un elenco di inclusione pianificato basato su un'esecuzione di pianificazione peptidica pesante spiegata qui utilizzando il software Skyline open source.<ol>
<li>Creare un elenco di destinazione come descritto nella sezione 4.1.</li>
		<li>Importare l'esecuzione della pianificazione in 3.1 selezionando File| Importa| Risultati.</li>
		<li>Rivedere le identificazioni. Il segnale pesante per ogni peptide è osservabile cliccando sulla massa per ogni ingresso peptidico pesante. Il corretto riconoscimento del picco viene spesso determinato automaticamente, ma il software potrebbe richiedere la cura manuale selezionando il picco utilizzando il clic e il trascinamento sotto l'asse x.</li>
		<li>I tempi di ritenzione selezionati per le varianti pesanti vengono applicati anche alle versioni leggere, creando così una pianificazione per il PRM. La finestra di pianificazione può essere modificata in Impostazioni| Impostazioni peptidiche mediante la scheda Previsione, modificando la finestra di tempo.</li>
		<li>Un elenco di inclusione pianificato può ora essere esportato utilizzando File| Esporta| Elenco di isolamento e selezione del tipo di strumento appropriato e impostazione del tipo di metodo su Programmato.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizzare i dati.<ol>
<li>Importare i campioni nello stesso modo dell'analisi di esecuzione della programmazione nella sezione 4.2.</li>
		<li>Dopo l'importazione completa di tutti i campioni, si consiglia la cura delle transizioni. Questo è il processo attraverso il quale vengono rimosse le transizioni con interferenze o scarsi rapporti segnale-rumore. Un esempio di cromatogramma prima e dopo la cura è illustrato nella figura 4.</li>
		<li>I dati possono ora essere esportati facendo clic con il pulsante destro del mouse sui grafici pertinenti e selezionando Copia dati o selezionando File| Esporta| Risultati.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

L'analisi dello stato di ubiquitina all'interno di un proteoma è sempre più importante per un'ampia varietà di questioni biologiche. La descrizione dello stato di ubiquitinazione di un campione deve concentrarsi non solo sul profilo delle proteine ubiquitinate, ma anche sulla topologia di tale ubiquitinazione. La valutazione di questa topologia da parte degli Stati membri mirati, come descritto in questa sede, ha un ruolo in un'ampia gamma di indagini biologiche.
Va capito che il protocollo qu...

La stretta regolazione della funzione e della stabilità proteica è di fondamentale importanza, in quanto sono i principali motori del controllo fenotipico della biologia. La funzione di una proteina è costruita da due componenti: la sua sequenza intrinseca di polipeptidi e qualsiasi modificazione posttraslazionale (PTM). Sono state identificate varie PTM chimiche tra cui glicosilazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione1. Nel 1975, Goldstein etal. L'ubiquitina è stata trovata importante nella degradazione delle proteine3. Tuttavia, da allora è stato stabilito che la funzione dell'ubiquitina come molecola di segnalazione si estende ben oltre la regolazione della stabilità proteica. La segnalazione dell'ubiquitina è coinvolta in una vasta gamma di altre funzioni biologiche, come la stabilizzazione delle proteine, l'autofagia, il controllo del ciclo cellulare e il trafficoproteico 4.
Mentre altre PTM sono generalmente binarie (cioè, la proteina viene modificata o lasciata non modificata) per un dato sito, l'ubiquitina può modificare una proteina sia come monomero che come catena polimerica, con l'ubiquitinazione stessa attaccata. Inoltre, questa catena di poliubiquitinazione può svilupparsi in diverse topologie con l'ubiquitinazione della precedente ubiquitina allegandosi a uno degli otto siti di collegamento5,6. L'ubiquitina viene trasferita da un processo enzimatico multipasso (Figura 1) in cui il C-terminale dell'ubiquitina è collegato a uno dei suoi sette residui di lisina (K06, K11, K27, K29, K33, K48 o K63) o all'N-terminale dell'ubiquitina precedente (indicato come m1 o ubiquitinazione lineare)5,6. Questa topologia a catena è la chiave del destino della proteina in fase di modifica. Ad esempio, la modifica con una catena collegata K48 o K11 porta alla degradazione della proteina modificata al proteasome, mentre una catena lineare è necessaria per l'attivazione della segnalazione NF-kB. Pertanto, la distribuzione relativa di queste topologie a catena è rilevante per un'ampia varietà di questioni biologiche.
L'uso della spettrometria di massa (SM) è di particolare beneficio per l'analisi della topologia della catena di ubiquitina in quanto non dipende da interazioni basate suanticorpi o affinità 7,8, molte delle quali hanno una specificità limitata e non distinguono tra i vari tipi di catena. Un'altra possibilità di rilevamento è l'uso di mutanti ubiquitina geneticamente modificati. Qui, una lysina specifica viene scambiata con arginina, che non può supportare la modifica con ubiquitina. La mancanza di formazione di catena di ubiquitina sulla proteina del substrato viene quindi interpretata come prova di una topologiaspecifica 9.
L'identificazione basata sulla SM delle proteine ubiquitinate si basa sul fatto che il C-terminale dell'ubiquitina contiene un residuo di arginina nella posizione 74 che è riconosciuto dalla trippasina durante la preparazione proteolitica dei campioni per l'analisi MS, separando la doppia glicina C-terminale. Questo GlyGly (-GG) rimane attaccato al ε-ammino del residuo di lisina della proteina del substrato. Per l'analisi della topologia dell'ubiquitina, la modifica avviene su uno dei sette residui di lisina dell'ubiquitina. In questo modo viene creato un insieme di sette peptidi chiave che trasportano un residuo di lisina modificato da GG, specifico per ciascuna delle topologie (Figura 2). Ad esempio, con la topologia K06, la lisina in posizione 6 sulla sequenza amminoacido sarà protetta dalla digestione triptica con una modifica -GG di 114 Da aggiunta a questa lisina.
L'identificazione di peptidi predeterminati specifici da parte della SM è indicata come proteomica mirata, o più specificamente, acquisizione mirata di peptidi10. Sono stati sviluppati due metodi a seconda delle prestazioni dello spettrometro di massa utilizzato. Questi sono il monitoraggio della reazione selezionata (SRM), chiamato anche monitoraggio della reazione multipla (MRM) e monitoraggio della reazione parallela (PRM). L'SRM comporta la selezione di transizioni costituite dal precursore m/z e dal prodotto ione m/z. Al contrario, il PRM richiede solo il precursore m/z. Dopo la selezione, viene eseguita una scansione completa del sondaggio degli ioni prodotto. Ciò ha il vantaggio che non è necessaria alcuna selezione di ioni di prodotto appropriati per la quantificazione sullo spettrometro di massa specifico prima della misurazione11. Sia SRM che PRM possono, a seconda dello strumento, essere programmati. La programmazione è la pratica di assegnare un lacime temporale durante il quale un particolare ione sarà incluso per l'analisi, poiché i peptidi stanno eluendo in tempi di conservazione definiti dal sistema cromatografico. La riduzione del numero di ioni interrogati in un dato momento aumenta la frequenza di interrogatorio degli ioni programmati in quel momento, migliorando così l'accuratezza dei dati.
In generale, l'applicazione di proteomica mirata per la topologia dell'ubiquitina è la stessa di qualsiasi altro esperimento di proteomica mirato. Tuttavia, due differenze chiave sono importanti: in primo luogo, deve essere considerata la stabilità delle catene di ubiquitina. Ci sono più potenti enzimi deubiquitinanti (DBA) che degradano rapidamente le catene sulla lisi cellulare. Le proteasi ubiquitina-specifiche si suddividono in due categorie: le tioesterasi e le metalloproteasi. La maggior parte delle ubiquitina-idrolasi sono tioesterasi e trasportano un residuo di cisteina nel loro centro attivo. Alchilando questo residuo di cisteina, possono essere inattivati. Come tale, l'uso di tamponi di stabilizzazione dell'ubiquitina contenenti agenti alchilanti, come la N-etilmaleimide (NEM), e sostanze chimiche altamente denaturanti, e mantenere i campioni refrigerati è vitale per un'analisi di successo. In secondo luogo, a differenza di altri esperimenti mirati, la scelta peptidica è fissa. In un tipico esperimento mirato, un peptide proteotipico può essere selezionato per buone prestazioni cromatografiche e ionizzazioni. Per alcuni peptidi caratteristici della topologia come K48 queste proprietà sono buone, mentre per altre sono meno desiderabili. Ad esempio, la cromatografia K33 in una tipica configurazione in fase inversa è scarsa a causa della formazione di un profilo di eluizione allungato e le scarse proprietà di ionizzazione del peptide K27 riducono la sua visibilità di MS12.
In questo protocollo, descriviamo come eseguire la valutazione della topologia dell'ubiquitina di un campione biologico da parte del PRM. I dati di esempio per la procedura sono presentati utilizzando una perturbazione del proteasome utilizzando il trattamento inibitore MG-132 in diversi tipi di cellule.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile (ACN)</td><td>Merck</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>Cloroacetammide (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico (FA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>Peptidi pesanti</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC Colonna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimmide (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>Catena di controllo positivo K48</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>Catena di controllo positivo K63</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>Catena di controllo positivo M1</td><td>Boston Biochem</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sonificatore</td><td>Sonificatore Branson</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Promega</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>Acque &mu; Elution C18 placche</td><td>Acque</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi della catena ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

La valutazione del profilo globale delle topologie a catena di ubiquitina all'interno di un proteoma è interessante per rispondere a un'ampia gamma di domande biologiche. Il protocollo qui delineato sfrutta la modifica della diglicina (-GG) lasciata dopo la digestione triptica dell'ubiquitina incorporata in una catena. Quantificando questi peptidi caratteristici della topologia si può determinare l'abbondanza relativa di ogni topologia a catena di ubiquitina. Le misure necessarie per quantificare questi peptidi mediante un esperimento parallelo di monitoraggio della reazione sono riportate tenendo conto della stabilizzazione delle catene di ubiquitina. La preparazione di controlli pesanti, lisi cellulare e digestione sono descritti insieme all'appropriata configurazione dello spettrometro di massa e al flusso di lavoro di analisi dei dati. Viene presentato un set di dati di esempio con perturbazioni nella topologia ubiquitina, accompagnato da esempi di come l'ottimizzazione del protocollo può influire sui risultati. Seguendo i passaggi descritti, un utente sarà in grado di eseguire una valutazione globale del paesaggio della topologia dell'ubiquitina all'interno del proprio contesto biologico.

Per dimostrare l'uso di un'analisi della catena di ubiquitina da parte del PRM, sono state selezionate tre linee cellulari: una linea cellulare di melanoma del topo B16 e le due comuni linee cellulari umane A549 (cellule epiteliali basali alveolari adenocarcinomiche) e HeLa (cellule tumorali cervicali). Queste colture sono cresciute fino alla fase semiesonziale in mezzi appropriati prima di essere trattate con 0, 10 o 100 mM MG-132 per 4 ore prima della raccolta. MG-132 è un inibitore del proteasome che impedisce la degr...

Questo metodo descrive la valutazione dei cambiamenti globali nella topologia della catena di ubiquitina. La valutazione viene eseguita mediante l'applicazione di un approccio di proteomica mirata basato sulla spettrometria di massa.

Analisi della catena Ubiquitin mediante monitoraggio parallelo della reazione

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Poiché diverse topologie di catene di ubiquitina hanno un'ampia gamma di effetti biologici, la comprensione dei cambiamenti nella loro abbondanza è rilevante per un'ampia varietà di stati biologici. L'applicazione del monitoraggio delle reazioni parallele all'analisi della catena dell'ubiquitina consente l'identificazione e la quantificazione specifica delle topologie della catena dell'ubiquitina. A differenza dei tipici esperimenti PRM, l'analisi della topologia della catena dell'ubiquitina è limitata a specifici peptidi modificati, molti dei quali non sono ideali per l'analisi della MS.La dimostrazione visiva di questa tecnica evidenzia gli aggiustamenti e i risultati attesi osservati per questi peptidi non ideali. Inizia preparando una soluzione di bicarbonato di ammonio, una soluzione di n-etilmaleimmide e un tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina come descritto nel manoscritto del testo. Risospendere il campione biologico nel tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina e lisare le cellule con un metodo appropriato.Dopo la lisi cellulare, centrifugare il campione a 18.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca a basso contenuto proteico. Se necessario, conservare i campioni a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius prima di procedere. Per scongelare i campioni, mescolarli rapidamente con un ThermoMixer e non utilizzare temperature superiori a 50 gradi Celsius.Una volta scongelati, centrifugare i campioni a 18.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire 20 microgrammi in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame, quindi regolare il volume a 50 microlitri con tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina. Preparare un controllo negativo con un volume normalizzato di tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina e un controllo positivo con il tampone e i tipi di catena disponibili in commercio. Preparare una soluzione di bicarbonato di ammonio 50 millimolare in acqua e regolare il pH a otto con un idrossido di sodio molare.Pellettare una coltura di E.coli mediante centrifugazione a 5.000 volte G per cinque minuti. Lavare le cellule due volte con PBS e risospenderle in un tampone di stabilizzazione dell'ubiquitina a cinque microgrammi per millilitro. Aggiungere un microgrammo di lisato di E.coli a ciascun campione e controllare.Quindi preparare 500 millimolari di TCEP in acqua di grado MS e aggiungerlo a ciascun campione fino a una concentrazione finale di 50 millimolari. Agitare brevemente i campioni e incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, preparare una soluzione di cloroacetaldeide da 500 millimolari e bicarbonato di ammonio e aggiungerla ai campioni e controllare fino a una concentrazione finale di 55 millimolari.Agitare brevemente i campioni e incubarli al buio per 20 minuti. Aggiungere l'endopeptidasi Lys-C ai campioni e incubarli a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo l'incubazione, diluire i campioni con 200 microlitri di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari, aggiungere tripsina e incubarli per altre 12 ore.Il giorno successivo, aggiungere una soluzione di acido formico al 10% a ciascun campione e controllare con un rapporto volume/volume di 1:10. Verificare che il pH sia inferiore a tre. Quindi aggiungere 0,5 microlitri di peptide pesante standard a ciascun campione.Dopo la pulizia standard del campione di C18, procedere con l'analisi di spettrometria di massa dei campioni con una metodologia basata su PRM. Per esportare l'elenco di isolamento, selezionare l'elenco di isolamento dal menu di esportazione, selezionare il tipo di strumento e impostare il metodo su standard. Fare clic su OK per aprire una richiesta di salvataggio di un file CSV che può essere utilizzato per creare un metodo PRM.Quindi, importare l'esecuzione della pianificazione selezionando File, Importa e Risultati. Scegli più file da importare contemporaneamente e fai clic su OK, quindi seleziona i file e attendi il completamento dell'importazione. Quando si è pronti, rivedere le identificazioni facendo clic sulla massa per ogni ingresso di peptide pesante.Il corretto riconoscimento del picco viene spesso determinato automaticamente, ma potrebbe essere necessaria una cura manuale. I tempi di ritenzione selezionati per le varianti pesanti vengono applicati anche alle versioni leggere, creando una schedulazione per il PRM. Per modificare la finestra di programmazione, selezionare il picco e fare clic su Impostazioni e Impostazioni peptidi.Quindi modifica l'intervallo di tempo nella scheda Previsione. L'elenco di inclusione della pianificazione può quindi essere esportato utilizzando File, Esporta ed Elenco di isolamento. Scegliere il tipo di strumento appropriato, impostare il tipo di metodo su programmato e fare clic su OK.To analizzare i dati, importare tutti i campioni ed eseguire la cura, rimuovendo le transizioni con interferenze o scarsi rapporti segnale/rumore, quindi esportare i dati facendo clic con il pulsante destro del mouse sui grafici pertinenti e selezionando Copia dati o facendo clic su File, Esporta e Report.Il trattamento con l'inibitore del proteasoma MG-132 previene la degradazione delle proteine coniugate dell'ubiquitina, che si traduce in un aumento della catena K48 nella linea cellulare di melanoma di topo B16, così come nelle due linee cellulari umane, A549 e HeLa. Il monitoraggio delle reazioni parallele o PRM esegue una scansione ionica completa del prodotto dopo la selezione dello ione precursore, il che significa che gli ioni del prodotto devono essere curati dopo l'esecuzione. Il cromatogramma per K48 è mostrato prima e dopo la polimerizzazione.Sono stati rimossi gli ioni prodotti che hanno un segnale con un profilo di eluizione incoerente e bassa intensità. La transizione selezionata durante la cura dovrebbe essere coerente tra gli esperimenti, ma può differire a seconda delle condizioni cromatografiche, delle impostazioni di analisi e del background biologico del campione. Qui sono mostrati i cromatogrammi ionici tipici per ciascuna delle topologie di catena dell'ubiquitina identificate in questo esperimento.Quando si progetta un esperimento PRM, l'energia di collisione può essere ottimizzata per migliorare il segnale. Quando sono state applicate energie di collisione da 14 a 28, si è scoperto che un'energia di collisione più alta di 26 era ottimale per K63, mentre un'energia più bassa di 18 era ideale per M1. Sono state trovate energie di collisione favorevoli per i peptidi caratteristici della topologia in questo esperimento e per una selezione di frammenti di ubiquitina non modificati, ma potrebbe essere necessario ottimizzarle in base allo spettrometro di massa e al metodo di frammentazione utilizzato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che per l'analisi della catena dell'ubiquitina, è necessario creare un equilibrio di condizioni per garantire che i collegamenti della catena dell'ubiquitina siano mantenuti, promuovendo al contempo la loro digestione in peptidi.Questo metodo è vitale per la comprensione della segnalazione dell'ubiquitina in quanto fornisce una quantificazione accurata della topologia della catena dell'ubiquitina. Potrebbe essere combinato con un pull-down o un frazionamento degli organelli per risolvere il problema della topologia della catena dell'ubiquitina associata al campione proteico mirato.

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Questo protocollo è progettato per quantificare in modo efficiente l'attività del sistema upS (Ubiquitin-proteasome System) in diversi compartimenti cellulari del cervello dei roditori. Gli utenti sono in grado di esaminare il funzionamento dell'UPS nelle frazioni nucleari, citoplasmatiche e sinaptiche nello stesso animale, riducendo il tempo e il numero di animali necessari per eseguire queste complesse analisi.

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Il presente studio fornisce protocolli dettagliati di test di ubiquitilazione in vitro per l'analisi dell'attività catalitica dell'ubiquitina ligasi E3. Le proteine ricombinanti sono state espresse utilizzando sistemi procariotici come la coltura di Escherichia coli.

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

Forniamo un protocollo dettagliato per un test di ubiquitilazione di un substrato specifico e un'ubiquitina-ligasi E3 in cellule di mammifero. Le linee cellulari HEK293T sono state utilizzate per la sovraespressione proteica, il substrato poliubiquitilato è stato purificato dai lisati cellulari mediante immunoprecipitazione e risolto in SDS-PAGE. L'immunoblotting è stato utilizzato per visualizzare questa modifica post-traduzionale.

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