Sintesi di Nanoparticelle d'oro modificate Aptamer-PEI-g-PEG Caricate con doxorubicina per la consegna mirata di farmaci

In questo protocollo, le nanoparticelle d'oro modificate AS1411-g-PEI-g-PEG caricate con doxorubicina vengono sintetizzati tramite reazioni di ammide in tre step. Quindi, la doxorubicina viene caricata e consegnata alle cellule tumorali bersaglio per la terapia del cancro.

A causa della resistenza ai farmaci e della tossicità, l'uso di doxorubicina è limitato in clinica. Questo protocollo fornisce un vettore degradabile per mantenere il rilascio di questo agente terapeutico. Il vantaggio di questo metodo è che il vettore sintetizzato può essere utilizzato per somministrare il farmaco direttamente alle cellule tumorali, inducendo la morte cellulare solo nelle cellule tumorali.

Per la sintesi CT-PEG, aggiungere prima 1,46 grammi di anidride succinica e 209 milligrammi di 4-dimetilamminopiridina a un pallone a fondo tondo da 100 millilitri. Successivamente, aggiungere 15 millilitri di tetraidrofurano anidro al pallone e inserire un tappo di vetro nel pallone, prima di incubare la reazione per 30 minuti a zero gradi Celsius. Durante l'incubazione, aggiungere 4,208 grammi di PEG, 1,8 millilitri di trietilammina e 15 millilitri di tetraidrofurano anidro a un nuovo pallone e chiudere il pallone con un tappo di vetro.

Al termine dell'incubazione, utilizzare una siringa in atmosfera di azoto per trasferire lentamente la seconda soluzione nel primo pallone. Mescolare la nuova soluzione per due ore a zero gradi Celsius, prima di continuare la reazione a temperatura ambiente per una notte. La mattina successiva, utilizzare un evaporatore rotante a 40 gradi Celsius e 0,1 megapascal per concentrare la soluzione di reazione e rimuovere il solvente tetraidrofurano.

Dopo un'ora, sciogliere la soluzione di reazione in 15 millilitri di 1,325 grammi per millilitro di diclorometano a temperatura ambiente, prima di aggiungere 15 millilitri di etere etilico freddo per ottenere il prodotto di precipitazione del diacido PEG. Quindi rimuovere il solvente con carta da filtro e asciugare il precipitato sotto vuoto per 48 ore a temperatura ambiente. Per la sintesi del copolimero PEI-g-PEG, aggiungere 305,47 milligrammi di precipitato CT-PEG e cinque millilitri di DMSO a un nuovo pallone e agitare la reazione a temperatura ambiente fino a quando il CT-PEG non è completamente disciolto.

Successivamente, sciogliere 49,46 milligrammi di EDC in cinque millilitri di DMSO e aggiungere la soluzione al pallone. Agitare la reazione per 30 minuti a temperatura ambiente, prima di sciogliere 29,69 milligrammi di N-idrossisuccinimide e cinque millilitri di DMSO e aggiungere la soluzione risultante al pallone. Continuare a mescolare la reazione per tre ore a temperatura ambiente.

Verso la fine dell'incubazione, sciogliere 28,6 microlitri di PEI in 10 millilitri di DMSO e aggiungere la soluzione goccia a goccia nel pallone. Mescolare la reazione a temperatura ambiente per almeno tre giorni. Al termine dell'incubazione, trasferire la soluzione reagita in una sacca per dialisi con un cutoff di peso molecolare di 1000 e posizionare la sacca in un becher da un litro contenente 500 millilitri di acqua ultra pura come dializzato.

Al termine della dialisi, trasferire la soluzione in una sacca per dialisi con un valore limite di 10.000 pesi molecolari e posizionare la sacca in un becher da un litro con 500 millilitri di acqua ultra pura come dializzato. Al termine della seconda dialisi, utilizzare un evaporatore rotante a 40 gradi Celsius e 0,1 megapascal per concentrare la soluzione e liofilizzare il campione per ottenere la polvere di PEI-g-PEG. Per il rivestimento di nanoparticelle d'oro con il prodotto PEI-g-PEG, sciogliere cinque milligrammi del PEI-g-PEG preparato in cinque millilitri di acqua ultra pura in un nuovo pallone e montare il pallone con un tappo di vetro.

Aggiungere 100 millilitri di soluzione di cloruro aurico 0,3 millimolare al pallone e agitare la soluzione per tre ore a temperatura ambiente. I colori dovrebbero cambiare immediatamente dal giallo chiaro al giallo scuro. Al termine dell'incubazione, aggiungere al pallone un millilitro di un milligrammo per millilitro di soluzione di boroidruro di sodio.

Il colore dovrebbe cambiare immediatamente dal giallo scuro al giallo dorato e mescolare la soluzione per altre tre ore a temperatura ambiente. Quindi dializzare il prodotto di reazione con una sacca per dialisi con cutoff di 1000 pesi molecolari per tre giorni, come dimostrato per ottenere la soluzione di nanoparticelle d'oro rivestita in PEI-g-PEG. Per l'innesto di doxorubicina alle nanoparticelle d'oro rivestite di PEI-g-PEG.

Aggiungere un millilitro di soluzione di doxorubicina da 2,2 milligrammi per millilitro e 20 millilitri della soluzione di nanoparticelle d'oro rivestita in PEI-g-PEG a un nuovo pallone e montare il pallone con un tappo di vetro. Quindi, sciogliere 0,727 milligrammi di EDC in un millilitro di acqua ultra pura e aggiungere la soluzione EDC al pallone. Sciogliere 0,437 milligrammi di N-idrossisuccinimide in un millilitro di acqua ultra pura e aggiungere la soluzione di N-idrossisuccinimide al pallone per un'incubazione di un'ora agitando a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, dializzare il prodotto di reazione in una sacca per dialisi con cutoff a 1000 pesi molecolari per tre giorni, come dimostrato per ottenere la soluzione di nanoparticelle d'oro rivestita di doxorubicina g-PEI-g-PEG. Per l'innesto dell'aptamero AS1411 al DOX-g-PEI-g-PEG. Aggiungere 20 millilitri della soluzione di nanoparticelle d'oro rivestita di doxorubicina DOX-g-PEI-g-PEG a una concentrazione di densità ottica di circa quattro di AS1411.

Sciogliere 28,76 milligrammi di EDC in un millilitro di acqua ultra pura e aggiungere la soluzione EDC al pallone. Sciogliere 17,27 milligrammi di N-idrossisuccinimide in un millilitro di acqua ultra pura e aggiungere la soluzione di N-idrossisuccinimide al pallone per un'incubazione di un'ora con agitazione a temperatura ambiente. Quindi dializzare il prodotto di reazione in una sacca per dialisi con cutoff di 1000 pesi molecolari per tre giorni, come dimostrato per ottenere nanoparticelle d'oro rivestite con AS1411-g-Doxorubicin-g-PEI-g-PEG.

La spettroscopia NMR protonica può essere utilizzata per confermare il successo della sintesi del polimero CT-PEG e dei copolimeri PIE-g-PEG. La spettroscopia ultravioletta può essere condotta per determinare il successo della funzionalizzazione e il caricamento graduale del copolimero preparato su nanoparticelle d'oro. La spettroscopia fotoelettronica a raggi X può essere utilizzata per studiare il legame chimico del copolimero su nanoparticelle d'oro.

La diffusione dinamica della luce può essere eseguita per determinare la distribuzione dimensionale delle nanoparticelle preparate. In questa analisi, la microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato nanoparticelle non raggruppate con una morfologia uniforme. L'analisi della vitalità cellulare ha rivelato una diminuzione del numero di cellule A549 nel tempo e in risposta all'aumento delle concentrazioni di nanoparticelle.

Rispetto al gruppo doxorubicina libera, il numero di cellule è aumentato, tuttavia, indicando una ridotta tossicità. Inoltre, l'analisi del profilo di rilascio della doxorubicina rivela che il rilascio prolungato di doxorubicina da nanoparticelle funzionalizzate ha causato una diminuzione delle cellule A549. La preparazione del copolimero PEI-g-PEG e le fasi di innesto AS1411 sono importanti per il successo dell'attuazione della procedura.

Lo stesso vettore di farmaci può essere ottenuto innestando AS1411 prima di innestare i farmaci, ma l'efficienza di caricamento del farmaco sarà ridotta.