Stabilire un modello di Cornea ex vivo suina per lo studio dei trattamenti farmacologici contro la cheratite batterica

Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per impostare un modello suino ex vivo di cheratite batterica. Pseudomonas aeruginosa è usato come organismo prototipico. Questo modello innovativo imita l'infezione in vivo in quanto la proliferazione batterica dipende dalla capacità del batterio di danneggiare il tessuto corneale.

Il modello di cheratite suina ex vivo qui presentato fornisce ai ricercatori che sviluppano nuovi antimicrobici un modello rappresentativo in vitro per determinare con maggiore precisione l'efficacia antimicrobica nelle fasi precliniche. Abbiamo usato Pseudomonas aeruginosa per questo esperimento, ma il modello funziona bene anche con altri batteri e organismi come funghi e lieviti. Utilizzare una pinza sterile per trasferire il bulbo oculare in una capsula di Petri.

Rimuovere la congiuntiva e il tessuto muscolare intorno al bulbo oculare utilizzando una lama di bisturi numero 15 e una pinza. Quindi, tenendo premuto il nervo ottico con la pinza, sollevare delicatamente il bulbo oculare e trasferirlo in un barattolo da mezzo litro riempito di PBS sterile. Una volta che tutti i bulbi oculari sono stati ripuliti dal tessuto circostante, usa una pinza sterile per spostarli in un altro barattolo da mezzo litro riempito con il 3% di iodio povidone in PBS.

Dopo che i bulbi oculari sono stati nel barattolo per un minuto, trasferiscili in un terzo barattolo contenente PBS sterile. Posiziona un bulbo oculare su una capsula di Petri pulita e usa la pinza per tenerla ferma. Con una lama di bisturi numero 10A, fai un taglio vicino alla cornea.

Usa le forbici per asportare la cornea lasciando circa tre millimetri di sclera che la circondano. Assicurarsi che l'estremità affilata delle forbici si trovi nello spazio sopracoroidale e non fori l'iride. Tenere premuto il bottone corneosclerale con una pinza e utilizzare un altro paio di pinze terminali appuntite per separare delicatamente il tessuto uveale.

Quindi sollevare il bottone corneosclerale per separarlo dal resto del bulbo oculare. Sciacquare brevemente il pulsante in una soluzione all'1,5% di iodio povidone in PBS. Quindi posizionare il bottone in PBS sterile in una piastra a 12 pozzetti.

Dopo aver elaborato non più di 40 bulbi oculari, posizionare ciascun bottone corneosclerale nella propria piastra di Petri da 34 millimetri con il lato epiteliale rivolto verso l'alto. Ad ogni piatto, aggiungere tre millilitri di terreno di coltura preriscaldato a 37 gradi Celsius. Incubare le piastre di Petri per 24 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale umidificato.

Utilizzare una tecnica asettica per rimuovere il terreno dalle piastre di Petri e sostituirlo con tre millilitri di terreno di coltura fresco preriscaldato contenente antibiotici. Dopo aver incubato le cornee per 48 ore, rimuovere nuovamente il terreno e sciacquare le cornee con due millilitri di PBS. Quindi aggiungere terreni privi di antibiotici e incubare per due o tre giorni per rimuovere gli antibiotici residui dal tessuto.

Cambia il supporto almeno un'altra volta entro questi tre giorni. Scartare le cornee se si sviluppa torbidità nel terreno privo di antibiotici. Aggiungere 10 millilitri di LB in un pallone conico da 50 millilitri con un tappo di schiuma.

Inoculare il brodo con una colonia di P.aeruginosa da una piastra di agar fresco e incubare a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore fino a quando i batteri non sono in fase di log intermedio. Trasferire la coltura batterica in una provetta da 50 millilitri e centrifugarla a 3.000 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in PBS.

Dopo aver lavato le cellule altre due volte e averle ririsospese in PBS, regolare la densità ottica della sospensione a 600 nanometri a circa 0,6 utilizzando PBS sterile come bianco. Rimuovere il terreno dalla capsula di Petri e sciacquare le cornee due volte con un millilitro di PBS sterile. Tenere la cornea con una pinza e stringerla delicatamente.

Utilizzare un bisturi 10A per eseguire quattro tagli, due verticali, due orizzontali nella sezione centrale del bottone corneosclerale attraverso lo strato epiteliale fino allo stroma sottostante. Posizionare uno stampo di vetro sterile in una piastra a sei pozzetti con la parte larga rivolta verso l'alto. Quindi posizionare la cornea al centro dello stampo di vetro con il lato dell'epitelio rivolto verso il basso e la parte ferita della cornea centrata nello stampo di vetro.

Riempire completamente lo stampo di vetro aggiungendo un millilitro di soluzione di agar. Dopo aver lasciato solidificare l'agar, capovolgere lo stampo di vetro in modo che l'epitelio corneale sia rivolto verso l'alto. Lo stampo di vetro deve essere sigillato con agar fino all'orlo per evitare la fuoriuscita dell'inoculo o della soluzione farmacologica.

Pipettare 200 microlitri di coltura batterica direttamente in un'area tagliata. Inoltre, per ogni esperimento, impostare un controllo aggiungendo 200 microlitri di PBS sterile a una cornea invece di aggiungere la coltura batterica. Quindi, aggiungi 185 microlitri di PBS sulla parte superiore di ciascuna cornea per mantenere umido l'epitelio.

Quindi aggiungere un millilitro di DMEM senza antibiotici sul fondo di ogni pozzetto. Incubare la piastra a sei pozzetti a 37 gradi Celsius con umidità e anidride carbonica al 5% per un massimo di 24 ore. Scartare il DMEM dalla piastra a sei pozzetti e un millilitro di PBS sterile in ciascun pozzetto per risciacquarlo.

Rimuovere delicatamente il PBS senza toccare la parte centrale del pulsante corneosclerale. Rimuovere lo stampo in vetro utilizzando una pinza sterile e posizionarlo in 5%Distel. Sciacquare delicatamente la parte superiore del bottone corneosclerale due volte con un millilitro di PBS.

Utilizzare una pinza a punta fine per sollevare il bordo del bottone corneosclerale, staccarlo dall'agar sottostante e trasferirlo in una provetta da 50 millilitri riempita con uno o due millilitri di PBS ghiacciato. Per aiutare a staccare i batteri dall'epitelio corneale e dall'area tagliata, aggiungere PBS al tubo e utilizzare un omogeneizzatore a punta fine per tagliare la parte superiore della cornea infetta. Il tessuto non deve essere completamente liquidato.

Vortice per risospendere i batteri sedimentati e aggiungere 20 microlitri di cornea omogeneizzata a 180 microlitri di PBS. Quindi eseguire diluizioni seriali dell'omogenato in una piastra a 96 pozzetti. Pipettare 10 microlitri di omogeneizzato diluito su una piastra di agar sanguigno.

Dopo aver incubato la piastra per 16 ore, contare il numero di unità formanti colonie. Le cornee suine di solito si gonfiano dopo alcuni giorni in ambiente medio. Non c'era alcuna differenza significativa nelle unità formanti colonie ottenute da cornee con e senza aggiunta di destrano, che di solito viene aggiunto per prevenire il gonfiore della cornea.

Le cornee sono in genere ferite per aiutare i batteri a penetrare nell'epitelio. Sebbene non vi fosse alcuna differenza significativa nel progresso dell'infezione tra cornee ferite e indesiderate, c'era una maggiore variazione tra le repliche nelle cornee ferite. Lavando le cornee due volte con PBS si rimuovono i batteri in eccesso che non si sono attaccati all'epitelio.

Esiste una differenza significativa nelle CFU tra le cornee suine lavate e non lavate infettate con P.aeruginosa PAO1 per 24 ore. Non c'è stata alcuna differenza significativa nella conta delle CFU tra cornee suine e conigliche infettate da PA14 e PAO1. I risultati per entrambi i modelli sono stati riproducibili.

Dopo 24 ore, le cornee infettate da entrambi i ceppi di Pseudomonas hanno sempre sviluppato opacità e l'area tagliata diventa più visibile e aperta rispetto alla cornea non infetta. Le cornee infette e trattate che sono state trattate con questo metodo possono essere ulteriormente utilizzate per la ceretta, la crioconservazione, il sezionamento, la colorazione con ematossilina e Olsen, l'immunocolorazione e la microscopia confocale. Il protocollo contribuisce a un maggiore controllo sulla progettazione e la formulazione dei farmaci nelle fasi precliniche, il che aumenterebbe il successo degli studi clinici, ridurrebbe l'uso di animali e si tradurrebbe in una traduzione più rapida di nuovi antimicrobici nella clinica.