Name: Un modello murino di esposizione fetale allinfiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Scopri un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite sullo sviluppo intestinale neonatale. Questo metodo aiuta a comprendere i meccanismi di lesione intestinale.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte attraverso il National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) e il Dipartimento di Pediatria della Famiglia Stead dell'Università dell'Iowa.

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Iowa (Protocol #8041401). Tutti gli animali sono stati ospitati in un vivarium approvato dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) presso l'Università dell'Iowa. Tutti i topi erano ceppo di tipo selvatico C57Bl/6J.
1. Istituzione del FEMI nei topi gravidi
<ol><li>Preparazione LPS<ol>
<li>Utilizzare LPS derivato da Escherichia coli O55:B5 (concentrazione di scorte 2 mg/mL).</li>
		<li>Diluire la concentrazione di materiale LPS 1:100 con salina sterile per una concentrazione di lavoro di 20 μg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniezione materna di LPS<ol>
<li>Iniettare dighe gravide al giorno di gestazione e15. Questo punto di tempo è di circa il 75% attraverso la gravidanza murina, rendendo questo modello simile allo sviluppo del terzo trimestre precoce delle gravidanze umane, che è quando si verifica la maggior parte delle nascite pretermine a causa della corioamionite.</li>
		<li>Pesare i topi gravidi immediatamente prima dell'iniezione per determinare il dosing LPS appropriato.</li>
		<li>Calcolare la dose di concentrazione di lavoro utilizzando la seguente formula: 5 μL x grammo di peso corporeo (gbw), per una dose totale di LPS di 100 μg/kg. Per controllare gli animali, utilizzare un volume equivalente di soluzione salina normale per iniezione.</li>
		<li>Soluzione Vortex LPS tre volte per 15 secondi in altezza prima di ogni iniezione.</li>
		<li>Redigere il volume LPS in una siringa da 1 ml.</li>
		<li>Trattenere il topo incinta con la tecnica dello scruffing. Tenere premuto in posizione di reclinamento dorsale ed eseguire l'iniezione.<ol>
<li>Inserire un ago da 30 gauge da 8 mm che si smussa sovrascriva il quadrante inferiore destro dell'addome (per evitare vesciche e vasi addominali) con un angolo di 30\u201240°. Inserire circa 1/4 a 1/2 della lunghezza dell'ago.</li>
			<li>Tirare indietro sullo stantuffo della siringa per garantire una pressione negativa prima dell'iniezione. Procedere con l'iniezione se è presente una pressione negativa.</li>
			<li>Dopo l'iniezione, monitorare i topi per circa 30 minuti e quindi tornare in gabbia per il resto della gravidanza.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Consegna e cura della prole e raccolta intestinale
<ol><li>Consegnare i cuccioli normalmente tramite parto vaginale a e20. NOTA: Questo modello ha un tasso di perdita fetale dose-dipendente previsto che può essere visto nella figura 1 ed è discusso nei risultati seguenti.</li>
	<li>Consenti ai cuccioli di rimanere con le madri e ricevere mangimi ad libitum.</li>
	<li>Il giorno della raccolta, tipicamente postnatale giorno 14 (P14), eutanasia i cuccioli tramite lussazione cervicale in conformità con i protocolli del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.</li>
	<li>Usando forbici e forcette, fai un'incisione verticale lungo la linea mediana dell'addome, attraverso la pelle e il peritoneo, per l'intera lunghezza dell'addome. Asportare l'intestino tenue dallo stomaco al cieco con le forbici e rimuovere il mesentere con le forcep.</li>
	<li>Isolare e mantenere il distale 1/3 dell'intestino tenue (sezione rappresentativa dell'ileo umano), scartando l'intestino tenue prossimale, il cieco e il colon.</li>
	<li>Dividere la porzione di ileo a metà usando le forbici.</li>
	<li>Posizionare la metà prossimale in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA per una successiva quantificazione dell'RNA.</li>
	<li>Posizionare la metà distale in formalina tamponata neutra al 10% per la preparazione dello scivolo.</li>
</ol>3. Punteggio lesioni intestinali
<ol><li>Sezionare il tessuto incorporato di paraffina in fette spesse 5 μm e montare su vetrini. NOTA: Inviamo gli esemplari a un nucleo istologico per l'incorporamento, la sessatura e il montaggio di paraffina su diapositive.</li>
	<li>Deparaffinizzare le diapositive secondo procedure standard.</li>
	<li>Sezioni di macchie con ematossilina ed eosina secondo procedure standard.</li>
	<li>Partitura di sezioni su una scala a 3 punti per lesioni intestinali come descrittoin precedenza 42,43.<ol>
<li>Utilizzando la microscopia ottica, valutare la lesione intestinale generalizzata da parte di due investigatori accecati separati su una scala a 3 punti che valuta l'integrità del villus e la separazione dalla membranabasale 43 (Figura complementare 1). La lesione intestinale è valutata al meglio con ingrandimento 20x e apertura numerica 0,50.</li>
		<li>Assegnare un punteggio di 0 per descrivere la mucosa normale.</li>
		<li>Assegnare un punteggio di 1 descrivere lesioni lievi che comprendono lo sviluppo dello spazio subepiteliale di Gruenhagen, la vacuolizzazione o il sollevamento subepiteliale limitato alla lamina propria o alle punte dei villi.</li>
		<li>Assegnare un punteggio di 2 per descrivere lesioni gravi, indicate dal sollevamento epiteliale e dalla vacuolizzazione superiore alla metà dei villi, distorsione villi o ulcerazione mucosa e disintegrazione della lamina propria.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Quantificazione delle cellule di Paneth e calice
<ol><li>A seguito della deparaffinizzazione, le diapositive di macchie di sezioni tissutali del passaggio 2.8 con macchia di Schiff blu/acido periodico alciano per indicare sia il calice che le cellule di Panethcome descritto in precedenza 44,45 secondo i seguenti passaggi. NOTA: Mentre la macchia di Schiff alcian Blue /Periodic Acid non è specifica né per le cellule paneth né per le cellule di calice, nella nostra esperienza, gli investigatori esperti accecati hanno una quantificazione cellulare equivalente utilizzando questa macchia rispetto agli anticorpi mirati cellulari, con una colorazione di fondo significativamenteinferiore 46.</li>
	<li>Deparaffinizzare, macchiare e disidratare le diapositive come segue.<ol>
<li>Immergere gli scivoli in xilene per 10 minuti due volte. ATTENZIONE: Lo xilene deve essere usato in una cappa aspirante.</li>
		<li>Risciacquare con EtOH al 100%.</li>
		<li>Immergere le diapositive in EtOH al 100 % per 3 minuti, quindi in EtOH al 90% per 3 minuti, seguite da EtOH al 70% per 3 minuti, e infine immergere le diapositive nel 50% di EtOH per 3 minuti.</li>
		<li>Lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti. ATTENZIONE: Puntaree la sezione dall'acqua corrente per evitare la perdita del campione di tessuto.</li>
		<li>Filtrare la soluzione di macchia blu alciana con un filtro da caffè standard.</li>
		<li>Le macchie scivolano nella macchia blu alciana per 15 minuti e quindi lavano sotto l'acqua corrente del rubinetto per 2 minuti.</li>
		<li>Diluire 1 mg di acido periodico in 200 mL di acqua distillata doppia. Immergere le diapositive in questa soluzione per 5 minuti. Quindi lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 1 minuto.</li>
		<li>Macchiare con il reagente di Schiff per 10 minuti. Lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti.</li>
		<li>Colla gli scivoli con ematossilina per 1 minuto e quindi lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 2 minuti.</li>
		<li>Immergerli nell'alcole acido (1 mL di acido cloridrico miscelato in 99 mL del 70% di EtOH) per 1 min.</li>
		<li>Immergere nell'acqua del rubinetto di Scott (concentrazione dello 0,1% di NaHCO3 nell'acqua del rubinetto) per 1 minuto e quindi lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 1 minuto.</li>
		<li>Disidratare le diapositive.<ol>
<li>Immergere ogni diapositiva 10 volte in 70% EtOH, quindi immergere 10 volte in 90% EtOH e 10 volte in EtOH al 100%.</li>
			<li>Immergere le diapositive in EtOH al 100% per 10 minuti, seguite da immergersi due volte in xilene fresco per 3 minuti ciascuna.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Posizionare una goccia di supporto di montaggio sul campione e posizionare una coverlip su di esso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conteggio delle celle di Calice<ol>
<li>Utilizzando la microscopia ottica, contare le cellule del calice (Figura complementare 2). Per ogni pezzo di tessuto intestinale, contare il numero di cellule calici e 500 cellule epiteliali e esprimere il rapporto cellulare del calice come rapporto per 100 cellule epiteliali. Le celle di calice sono conteggiate al meglio con ingrandimento 20x e apertura numerica 0,5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conteggio delle celle di Paneth<ol>
<li>Utilizzando la microscopia ottica, contare le celle di Paneth (Figura complementare 2). Per ogni pezzo di tessuto intestinale, esprimere come un rapporto di cellule paneth per cripta intestinale. Conta 100 cripte intestinali per ogni pezzo di tessuto intestinale. Le celle paneth sono conteggiate al meglio con ingrandimento 20x-60x e apertura numerica 0,50-1,30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La corioamniionite ha un impatto sul 2\u20124% del termine e sul 25\u201230% delle consegne pretermine8,9. Tuttavia, l'impatto della corioamionite può estendersi a lungo oltre la nascita in quanto ha dimostrato di avere effetti significativi sul feto e sul neonato10,11,12,13,14,<sup class="x...

Le membrane corioniche svolgono un ruolo fondamentale nella gravidanza dei mammiferi. Includono il chorion e l'amnion, che servono più funzioni. Circondano e proteggono il feto, facilitano la segnalazione paracrina tra i compartimenti materno efetale 1e creano anelli di feedback locali all'interno delle membrane corioniche, che possono essere coinvolti nell'avvio della parto1. La comprensione attuale delle membrane indica che l'amnione fornisce una funzione di barriera strutturale e il corione fornisce un buffer immunologico principalmente per proteggere il feto in via di sviluppo dal sistema immunitariomaterno 2. L'infiammazione di queste membrane è nota come corioamionite. Storicamente, la diagnosi di corioamionite clinica è stata fatta in seguito alla presenza di febbre materna più uno o più risultati clinici fetali omaterni 3,4. Tuttavia, sebbene questa definizione sia clinicamente utile, la sua mancanza di precisione ha reso difficile la ricerca sulla corioamionite. Nel 2015, nel tentativo di chiarire la diagnosi, un workshop del gruppo di esperti dell'Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development ha definito la corioamniionite come infiammazione intrauterina, o infezione, o entrambi (tripla I)3. Questo chiarimento è importante perché mentre l'infezione indotta microbica è una causa importante di infiammazione uterina / amniotica, si verifica meno comunemente dell'infiammazione uterina / amniotica sterile5,6,7. Nel complesso, la corioamniionite rimane un problema significativo di salute pubblica, come si vede nel 2\u20124% delle consegne a termine e nel 25\u201230% delle consegne pretermine8,9.
La corioamionite può avere effetti significativi sul feto e sul neonato. È stato ben documentato in letteratura che la corioamionite è associata ad un aumento del rischio di molte delle morbilità della prematurità, tra cui la displasia broncopolmonare10,la lesione cerebrale della materia bianca11,l'emorragia intraventricolare12,la retinopatia della prematurità13e la sepsi neonatale ad esordio precoce sospetta e confermata14,15. Poiché siamo interessati a meccanismi di lesione e riparazione del tratto intestinale immaturo, è importante notare che la corioamniionite è anche associata a un successivo sviluppo di enterocolite necrotizzante (NEC)15,16. Il NEC è una devastante malattia gastrointestinale dei neonati pretermine che si traduce in una risposta dell'ospite disregolata all'infiammazione e alla successiva necrosiintestinale 17. Ogni anno, il NEC colpisce oltre 4000 neonati negli Stati Uniti e fino a un terzo di questi neonati muore a causa della malattia18. La patogenesi del NEC probabilmente comporta una combinazione di immaturità intestinale, disregolazione del sistema immunitario immaturo, infiammazione intestinale e traslocazionebatterica 19, che culmina in un ultimo percorso comune di necrosi intestinale. È importante sottolineare che l'insorgenza del NEC si verifica spesso settimane dopo la nascita e la potenziale esposizione alla corioamionite, rendendo poco chiaro il legame meccanicistico tra corioamniionite e successivo sviluppo del NEC20. Un potenziale meccanismo con cui la corioammintite può contribuire alla fisiopatologia del NEC è attraverso l'upregolazione del sistema immunitario materno, producendo successivamente una forte risposta infiammatoria fetale che può interrompere i normali modelli di sviluppofetale 21,22,23.
Nei roditori e nelle pecore esistono più modelli di corioamionite di mammiferi24,25,26,27,28,29,30,31,32. Tuttavia, esistono pochi dati relativi allo sviluppo del tratto intestinale oltre il periodo iniziale appena nato a seguito dell'esposizione fetale indotta dalla corioamnite all'infiammazione materna (FEMI). Al fine di esplorare la relazione tra il FEMI e il successivo sviluppo della lesione del tratto intestinale immaturo, abbiamo adattato il modello FEMI indotto dal lipoppiosaccaride (LPS). I lipopatolisaccaridi sono un componente importante della superficie extracellulare sui batteri gram negativi e sono un potente stimolante del sistema immunitario innato di più specie eucariotiche, compresi gli esseriumani 33. L'iniezione materna di LPS si traduce in una cascata infiammatoria sterile senza gli effetti confondenti dei batteri vivi, ed è un modello ben consolidato per l'induzione della nascita pretermine34, così come un modello di corioamionite acuta e la sindrome da risposta infiammatoria fetale (FIRS), che è la forma più grave di corioamniionite24,35. È stato anche dimostrato che induce lesioni cerebrali di materia bianca e grigia in una pecora modello36 e un murino modello37,38,39,40. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, siamo i primi a utilizzare questo modello di corioamionite e FEMI per indagare i suoi effetti sullo sviluppo del tratto gastrointestinale dopo la nascita, nonché per indagare un possibile legame meccanicistico tra corioamionite e successivo sviluppo di NEC41,42.

<table><tbody><tr><td>Formalina tamponata neutra al 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>colorazione blu Alcian</td><td>Fornitura nuovi arrivati</td><td>1003A</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl6/J topi</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Colorazione ematossilina</td><td>Leica</td><td>381562</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-U Microscopio</td><td>Nikon</td><td>2CE-MQVJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Acido periodico</td><td>ACROS</td><td>H5106</td><td>CAS # 10450-59-9</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermofisher</td><td>Am7021</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di Schiff</td><td>Sigma</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Secor Imager 2400</td><td>Scoperta su scala meso (MSD)Saggio</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>V-Plex</td><td>Scoperta su scala meso (MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

La corioamionite è un precipitante comune di nascita pretermine ed è associata a molte delle morbilità della prematurità, inclusa l'enterocolite necrotizzante (NEC). Tuttavia, un legame meccanicistico tra queste due condizioni rimane ancora da scoprire. Abbiamo adottato un modello murino di corioamnionite che coinvolge l'esposizione fetale indotta dal lipoppiosaccaride (LPS) all'infiammazione materna (FEMI). Questo modello di FEMI induce una cascata infiammatoria sterile materna, placentare e fetale, che è presente anche in molti casi di corioamionite clinica. Sebbene esistano modelli che utilizzano batteri vivi e imitano più accuratamente la fisiopatologia di un'infezione ascendente con conseguente corioamionite, questi metodi possono causare effetti indiretti sullo sviluppo del tratto intestinale immaturo e del microbioma in via di sviluppo associato. Utilizzando questo protocollo, abbiamo dimostrato che il FEMI indotto dall'LPS si traduce in un aumento dose-dipendente della perdita della gravidanza e della nascita pretermine, nonché in interruzione del normale sviluppo intestinale nella prole. Inoltre, abbiamo dimostrato che il FEMI aumenta significativamente la lesione intestinale e le citochine siere nella prole, riducendo contemporaneamente calice e cellule di Paneth, entrambe forniscono una prima linea di immunità innata contro l'infiammazione intestinale. Sebbene un modello simile di FEMI indotto dall'LPS sia stato utilizzato per modellare l'associazione tra corioamionite e successive anomalie del sistema nervoso centrale, a nostra conoscenza, questo protocollo è il primo a tentare di chiarire un legame meccanicistico tra corioamionite e successive perturbazioni nello sviluppo intestinale come potenziale legame tra corioamninite e NEC.

L'esposizione al FEMI il giorno 15 embrionale porta ad una perdita di gravidanza dose-dipendente e ad un'intensità dose-dipendente di lavoro pretermine (Figura 1)42. Per gli esperimenti, abbiamo scelto di utilizzare una dose LPS di 100 μg /kg per ridurre al minimo la perdita di gravidanza e la prematurità (perdita del 50% sia tra prematurità che per scomparsa fetale intrauterina) esponendo i feti a un significativo insulto infiammatorio.
Ut...

Abbiamo sviluppato un modello di corioamionite per simulare l'esposizione fetale all'infiammazione materna (FEMI) senza complicazioni di organismi vivi per esaminare gli effetti del FEMI sullo sviluppo del tratto intestinale della prole. Ciò consente lo studio delle cause meccaniche per lo sviluppo di lesioni intestinali a seguito della corioamionite.

Un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Questo protocollo FEMI consente di studiare gli effetti a lungo termine sui neonati in seguito all'esposizione fetale all'infiammazione materna. Ciò è particolarmente rilevante per lo sviluppo dell'enterocolite necrotizzante, o NEC. Questa tecnica imita l'infiammazione sterile che si osserva spesso nella corioamnionite e la mancanza di batteri vivi può avere effetti confondenti sul tratto intestinale in via di sviluppo e sul microbioma.Il passaggio più importante di questo protocollo è l'iniezione di LPS per indurre FEMI. È di fondamentale importanza che venga utilizzata una dose appropriata di LPS e che l'iniezione non causi traumi intraperitoneali al topo gravido. Iniziare diluendo il brodo LPS da uno a 100 con soluzione fisiologica sterile per una concentrazione di lavoro di 20 microgrammi per millilitro.Iniettare le madri gravide al giorno della gestazione E15. Pesare i topi immediatamente prima dell'iniezione per determinare il dosaggio appropriato di LPS, utilizzando un volume equivalente di soluzione fisiologica normale per gli animali di controllo. Agitare la soluzione LPS tre volte per 15 secondi alla massima potenza.Quindi aspirarlo in una siringa da un millilitro. Usa la tecnica dello scruffing per trattenere la topolina incinta e tienila in posizione di decubito dorsale. Inserire circa un quarto o metà di un ago da 30 gauge, otto millimetri smussato verso l'alto, sovrastante il quadrante inferiore destro dell'addome con un angolo di 30-40 gradi.Tirare indietro lo stantuffo della siringa per garantire una pressione negativa. Quindi procedere con l'iniezione se è presente una pressione negativa. Monitora i topi per circa 30 minuti, quindi rimettili nelle gabbie per il resto della gravidanza.Partoriscono i cuccioli tramite parto vaginale all'E20 e permetti loro di rimanere con le madri, ricevendo poppate ad libitum. Raccogli l'intestino al 14° giorno postnatale. Usa forbici e pinze per praticare un'incisione verticale lungo la linea mediana dell'addome, attraverso la pelle e il peritoneo, per l'intera lunghezza dell'addome.Asportare l'intestino tenue dallo stomaco al cieco e rimuovere il mesentere. Isolare il terzo distale dell'intestino tenue, scartando l'intestino tenue prossimale, il cieco e il colon. Dividi la porzione di ileo a metà usando le forbici.Quindi posizionare la metà prossimale in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA per la quantificazione dell'RNA e la metà distale in formalina tamponata neutra al 10% per la preparazione del vetrino. Sezionare il tessuto incluso in paraffina in fette spesse cinque micrometri e montarle su vetrini. Deparaffinare i vetrini, quindi colorare le sezioni con ematossilina ed eosina secondo le procedure standard.Utilizzare la microscopia ottica per valutare il danno intestinale generalizzato da parte di due investigatori in cieco separati su una scala a tre punti, valutando l'integrità dei villi e la separazione dalla membrana basale. Assegna un punteggio pari a zero per descrivere la mucosa normale. Assegnare un punteggio di uno per descrivere una lesione lieve, che include lo sviluppo dello spazio di Gruenhagen subepiteliale, la vacuolizzazione o il sollevamento subepiteliale limitato alla lamina propria o alle punte dei villi.Assegnare un punteggio di due per descrivere una lesione grave, indicata da sollevamento epiteliale e vacuolizzazione superiore alla metà dei villi, distorsione dei villi o ulcerazione della mucosa e disintegrazione della lamina propria. Immergere i vetrini nello xilene due volte per 10 minuti. Quindi sciacquarli con etanolo al 100%.Immergere i vetrini per tre minuti in etanolo al 100%, etanolo al 90%, etanolo al 70% e etanolo al 50%. Quindi lavare i vetrini sotto l'acqua corrente per cinque minuti, rivolti verso la sezione lontano dall'acqua per evitare la perdita del campione di tessuto. Filtrare la soluzione di macchia blu Alcian con un normale filtro da caffè e utilizzarla per colorare i vetrini per 15 minuti.Quindi lavateli sotto l'acqua corrente del rubinetto per due minuti. Diluire un milligrammo di acido periodico in 200 millilitri di acqua a doppia distillazione e immergere i vetrini in questa soluzione per cinque minuti. Dopo un minuto di lavaggio sotto l'acqua corrente, colorare i vetrini con il reagente di Schiff per 10 minuti e lavarli nuovamente per cinque minuti.Quindi, macchiali con ematossilina per un minuto e lavali con acqua per due minuti. Immergili nell'alcol acido per un minuto, poi nell'acqua del rubinetto di Scott per un minuto, seguito da un lavaggio sotto l'acqua corrente del rubinetto per un minuto. Per disidratare i vetrini, immergere ogni vetrino 10 volte in etanolo al 70%, etanolo al 90% e poi etanolo al 100%.Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 10 minuti, quindi immergerli due volte in xilene fresco per tre minuti ogni volta. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio sul campione e un vetrino coprioggetti sulla parte superiore. Conta le cellule caliciformi al microscopio.Per ogni pezzo di tessuto intestinale, contare il numero di cellule caliciformi e 500 cellule epiteliali. Quindi esprimere le cellule caliciformi come rapporto per 100 cellule epiteliali. Conta le celle di Paneth.Per ogni pezzo di tessuto intestinale, registrare il rapporto tra le cellule di Paneth per cripta intestinale, contando 100 cripte intestinali per ogni pezzo di tessuto intestinale. L'esposizione fetale all'infiammazione materna, o FEMI, al 15° giorno embrionale porta a una perdita di gravidanza dose-dipendente e a un tasso dose-dipendente di travaglio pretermine. La FEMI induce un danno intestinale significativo alla nascita e all'ottava settimana di vita.Questa lesione si verifica in assenza di stimoli aggiuntivi per gli animali, suggerendo che la FEMI da sola interrompe la normale omeostasi del tratto intestinale murino neonato. È stato quantificato il numero di cellule caliciformi produttrici di mucina e di cellule Paneth produttrici di peptidi antimicrobici nel terzo distale del tratto intestinale tenue. È stato riscontrato che il FEMI ha interrotto la normale composizione dell'epitelio intestinale inducendo la perdita di entrambi i tipi di cellule, rispetto agli animali senza FEMI.Per studiare gli effetti della FEMI sulla risposta infiammatoria neonatale, sono stati quantificati una varietà di marcatori infiammatori sierici, tra cui interleuchina-1 beta, interleuchina-10, KCGRO e interleuchina-6, dal siero di cuccioli con e senza FEMI. La FEMI ha aumentato significativamente la cascata infiammatoria per tutte le citochine a P0. La cascata infiammatoria in età avanzata differiva in base al punto temporale e alle citochine. È interessante notare che c'erano livelli simili di IL6 da P7 a P28 nei gruppi FEMI e sham.Tuttavia, ci sono stati livelli significativamente più alti nel gruppo FEMI a P56, nonostante nessun intervento secondario. È fondamentale eseguire una curva di dose iniziale dell'LPS, poiché diverse scorte di LPS possono avere potenze diverse. Abbiamo scoperto che i nostri esiti neonatali dipendono dalla dose di LPS utilizzata per indurre la FEMI.

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L'enterocolite necrotizzante (NEC) è la malattia gastrointestinale (GI) più grave che si verifica spesso nei neonati prematuri, in particolare nei neonati con peso alla nascita molto basso, con alta mortalità e patogenesi poco chiara. La causa del NEC può essere correlata ad anomalie del sistema immunitario infiammatorio. Un modello animale NEC è uno strumento indispensabile per la ricerca immunitaria sulla malattia NEC. I modelli animali NEC di solito usano topi neonatali C57BL / 6J; I topi...

Un modello murino BALB/c neonatale di enterocolite necrotizzante

Questo protocollo descrive un modello in vitro di enterocolite necrotizzante (NEC), che può essere utilizzato per studi meccanicistici sulla patogenesi della malattia. È dotato di un chip microfluidico seminato con enteroidi intestinali derivati dall'intestino neonatale umano, dalle cellule endoteliali e dal microbioma intestinale di un neonato con NEC grave.

Modello microfluidico di enterocolite necrotizzante che incorpora enteroidi intestinali neonatali umani e un microbioma disbiotico

Il parto pretermine (parto &lt; 37 settimane) è un problema urgente di salute globale con opzioni di prevenzione e trattamento non ottimali. Presentiamo un modello murino di parto pretermine indotto da infezione batterica vaginale ascendente e delineiamo come analizzare la morbilità e la mortalità neonatale risultanti.

Modellazione dell'infezione vaginale ascendente, della nascita pretermine e della morbilità neonatale nei topi

Questo protocollo delinea un modello murino neonatale di enterocolite necrotizzante (NEC) e il successivo isolamento delle cellule immunitarie della lamina propria dall'intestino tenue murino neonatale.

Un modello murino neonatale di enterocolite necrotizzante e isolamento della lamina propria per la profilazione delle cellule immunitarie

L'articolo fornisce un protocollo completo per generare un modello murino di attivazione immunitaria materna (MIA) per studiare gli effetti dell'infiammazione gestazionale precoce sul neurosviluppo, inclusi metriche chiave per garantire affidabilità e riproducibilità.

Generazione del modello murino con attivazione immunitaria materna gestazionale precoce per valutare l'infiammazione prenatale nello sviluppo neurologico

Scopri un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite sullo sviluppo intestinale neonatale. Questo metodo aiuta a comprendere i meccanismi di lesione intestinale.

Un modello murino di esposizione fetale allinfiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato (Video) | JoVE Journal

Un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato

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