Un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato

Abbiamo sviluppato un modello di corioamionite per simulare l'esposizione fetale all'infiammazione materna (FEMI) senza complicazioni di organismi vivi per esaminare gli effetti del FEMI sullo sviluppo del tratto intestinale della prole. Ciò consente lo studio delle cause meccaniche per lo sviluppo di lesioni intestinali a seguito della corioamionite.

Questo protocollo FEMI consente di studiare gli effetti a lungo termine sui neonati in seguito all'esposizione fetale all'infiammazione materna. Ciò è particolarmente rilevante per lo sviluppo dell'enterocolite necrotizzante, o NEC. Questa tecnica imita l'infiammazione sterile che si osserva spesso nella corioamnionite e la mancanza di batteri vivi può avere effetti confondenti sul tratto intestinale in via di sviluppo e sul microbioma.

Il passaggio più importante di questo protocollo è l'iniezione di LPS per indurre FEMI. È di fondamentale importanza che venga utilizzata una dose appropriata di LPS e che l'iniezione non causi traumi intraperitoneali al topo gravido. Iniziare diluendo il brodo LPS da uno a 100 con soluzione fisiologica sterile per una concentrazione di lavoro di 20 microgrammi per millilitro.

Iniettare le madri gravide al giorno della gestazione E15. Pesare i topi immediatamente prima dell'iniezione per determinare il dosaggio appropriato di LPS, utilizzando un volume equivalente di soluzione fisiologica normale per gli animali di controllo. Agitare la soluzione LPS tre volte per 15 secondi alla massima potenza.

Quindi aspirarlo in una siringa da un millilitro. Usa la tecnica dello scruffing per trattenere la topolina incinta e tienila in posizione di decubito dorsale. Inserire circa un quarto o metà di un ago da 30 gauge, otto millimetri smussato verso l'alto, sovrastante il quadrante inferiore destro dell'addome con un angolo di 30-40 gradi.

Tirare indietro lo stantuffo della siringa per garantire una pressione negativa. Quindi procedere con l'iniezione se è presente una pressione negativa. Monitora i topi per circa 30 minuti, quindi rimettili nelle gabbie per il resto della gravidanza.

Partoriscono i cuccioli tramite parto vaginale all'E20 e permetti loro di rimanere con le madri, ricevendo poppate ad libitum. Raccogli l'intestino al 14° giorno postnatale. Usa forbici e pinze per praticare un'incisione verticale lungo la linea mediana dell'addome, attraverso la pelle e il peritoneo, per l'intera lunghezza dell'addome.

Asportare l'intestino tenue dallo stomaco al cieco e rimuovere il mesentere. Isolare il terzo distale dell'intestino tenue, scartando l'intestino tenue prossimale, il cieco e il colon. Dividi la porzione di ileo a metà usando le forbici.

Quindi posizionare la metà prossimale in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA per la quantificazione dell'RNA e la metà distale in formalina tamponata neutra al 10% per la preparazione del vetrino. Sezionare il tessuto incluso in paraffina in fette spesse cinque micrometri e montarle su vetrini. Deparaffinare i vetrini, quindi colorare le sezioni con ematossilina ed eosina secondo le procedure standard.

Utilizzare la microscopia ottica per valutare il danno intestinale generalizzato da parte di due investigatori in cieco separati su una scala a tre punti, valutando l'integrità dei villi e la separazione dalla membrana basale. Assegna un punteggio pari a zero per descrivere la mucosa normale. Assegnare un punteggio di uno per descrivere una lesione lieve, che include lo sviluppo dello spazio di Gruenhagen subepiteliale, la vacuolizzazione o il sollevamento subepiteliale limitato alla lamina propria o alle punte dei villi.

Assegnare un punteggio di due per descrivere una lesione grave, indicata da sollevamento epiteliale e vacuolizzazione superiore alla metà dei villi, distorsione dei villi o ulcerazione della mucosa e disintegrazione della lamina propria. Immergere i vetrini nello xilene due volte per 10 minuti. Quindi sciacquarli con etanolo al 100%.

Immergere i vetrini per tre minuti in etanolo al 100%, etanolo al 90%, etanolo al 70% e etanolo al 50%. Quindi lavare i vetrini sotto l'acqua corrente per cinque minuti, rivolti verso la sezione lontano dall'acqua per evitare la perdita del campione di tessuto. Filtrare la soluzione di macchia blu Alcian con un normale filtro da caffè e utilizzarla per colorare i vetrini per 15 minuti.

Quindi lavateli sotto l'acqua corrente del rubinetto per due minuti. Diluire un milligrammo di acido periodico in 200 millilitri di acqua a doppia distillazione e immergere i vetrini in questa soluzione per cinque minuti. Dopo un minuto di lavaggio sotto l'acqua corrente, colorare i vetrini con il reagente di Schiff per 10 minuti e lavarli nuovamente per cinque minuti.

Quindi, macchiali con ematossilina per un minuto e lavali con acqua per due minuti. Immergili nell'alcol acido per un minuto, poi nell'acqua del rubinetto di Scott per un minuto, seguito da un lavaggio sotto l'acqua corrente del rubinetto per un minuto. Per disidratare i vetrini, immergere ogni vetrino 10 volte in etanolo al 70%, etanolo al 90% e poi etanolo al 100%.

Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 10 minuti, quindi immergerli due volte in xilene fresco per tre minuti ogni volta. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio sul campione e un vetrino coprioggetti sulla parte superiore. Conta le cellule caliciformi al microscopio.

Per ogni pezzo di tessuto intestinale, contare il numero di cellule caliciformi e 500 cellule epiteliali. Quindi esprimere le cellule caliciformi come rapporto per 100 cellule epiteliali. Conta le celle di Paneth.

Per ogni pezzo di tessuto intestinale, registrare il rapporto tra le cellule di Paneth per cripta intestinale, contando 100 cripte intestinali per ogni pezzo di tessuto intestinale. L'esposizione fetale all'infiammazione materna, o FEMI, al 15° giorno embrionale porta a una perdita di gravidanza dose-dipendente e a un tasso dose-dipendente di travaglio pretermine. La FEMI induce un danno intestinale significativo alla nascita e all'ottava settimana di vita.

Questa lesione si verifica in assenza di stimoli aggiuntivi per gli animali, suggerendo che la FEMI da sola interrompe la normale omeostasi del tratto intestinale murino neonato. È stato quantificato il numero di cellule caliciformi produttrici di mucina e di cellule Paneth produttrici di peptidi antimicrobici nel terzo distale del tratto intestinale tenue. È stato riscontrato che il FEMI ha interrotto la normale composizione dell'epitelio intestinale inducendo la perdita di entrambi i tipi di cellule, rispetto agli animali senza FEMI.

Per studiare gli effetti della FEMI sulla risposta infiammatoria neonatale, sono stati quantificati una varietà di marcatori infiammatori sierici, tra cui interleuchina-1 beta, interleuchina-10, KCGRO e interleuchina-6, dal siero di cuccioli con e senza FEMI. La FEMI ha aumentato significativamente la cascata infiammatoria per tutte le citochine a P0. La cascata infiammatoria in età avanzata differiva in base al punto temporale e alle citochine. È interessante notare che c'erano livelli simili di IL6 da P7 a P28 nei gruppi FEMI e sham.

Tuttavia, ci sono stati livelli significativamente più alti nel gruppo FEMI a P56, nonostante nessun intervento secondario. È fondamentale eseguire una curva di dose iniziale dell'LPS, poiché diverse scorte di LPS possono avere potenze diverse. Abbiamo scoperto che i nostri esiti neonatali dipendono dalla dose di LPS utilizzata per indurre la FEMI.