Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

Questo protocollo facilita la preparazione di fette orizzontali di cervello ippocampale per il loro utilizzo in varie applicazioni scientifiche. Questa tecnica preserva l'integrità di tutte le vie delle fibre ippocampali all'interno di una singola fetta di emisfero. Questo protocollo slice è ideale per valutare i cambiamenti neurologici che si verificano nelle patologie cerebrali che si sviluppano e si manifestano nel giro dentato.

L'aspetto più importante di questo protocollo è trovare l'equilibrio tra un'esecuzione il più rapida possibile e la manipolazione delicata del tessuto cerebrale. Per preparare un litro di ACSF, mescolare lentamente tutte le sostanze chimiche solide come indicato in 800 millilitri di acqua agitando costantemente con un'ancoretta magnetica prima di sgocciolare lentamente nei volumi appropriati di solfato di magnesio e cloruro di calcio. Quindi utilizzare un osmometro a pressione di vapore per convalidare l'osmolarità tra 305 e 315 milliosmole e far bollire continuamente la soluzione ACSF a temperatura ambiente con carbogeno per impostare il pH tra 7,3 e 7,4.

Per preparare 250 millilitri di soluzione a fette ad alto contenuto di saccarosio, aggiungere i composti a 25 millilitri di soluzione preaffettata come indicato in tabella e verificare che l'osmolarità sia compresa tra 320 e 325 milliosmolo. Quindi far bollire la soluzione di fette ad alto contenuto di saccarosio per 10-15 minuti con carbogno per impostare il pH tra 7,3 e 7,4 e conservare la soluzione di fette ad alto contenuto di saccarosio per 20-30 minuti a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è parzialmente congelata. Per preparare uno spazio di lavoro per la dissezione, riempire una camera di recupero con una soluzione di ACSF carbogenata e posizionare la camera in un bagno d'acqua a 32 gradi Celsius.

Impostare il vibratomo sul programma di taglio appropriato e riempire il supporto di ghiaccio, montarlo sul vibratomo e fissare una lama al braccio del vibratomo. Con l'aiuto di una spatola schiacciare e mescolare la soluzione parzialmente congelata di fette ad alto contenuto di saccarosio fino ad ottenere una granita eterogenea. Quindi far bollire la soluzione con carbogeno e utilizzare la soluzione per idratare un pezzo di carta da filtro sopra un piatto di coltura refrigerato da 90 millimetri e riempire un piatto di coltura da 35 millimetri con ghiaccio.

Per prelevare il cervello, utilizzare le forbici da dissezione per aprire il cuoio capelluto di un topo maschio di età compresa tra due e sei settimane e per aprire la calvaria lungo la sutura sagittale. Usa una pinza curva per rimuovere il cranio fino a quando l'intero cervello, compresi i bulbi olfattivi, è visibile e usa una spatola per estrarre con cura il tessuto cerebrale intatto. Metti il cervello nel piatto di coltura da 35 millimetri e usa una pipetta Pasteur riempita con una soluzione di fette ad alto contenuto di saccarosio per rimuovere delicatamente eventuali peli o particelle di sangue dal tessuto.

Usa la spatola per trasferire il cervello pulito sul pezzo di carta da filtro imbevuta e usa una lama per tagliare il cervello longitudinalmente a metà. Posiziona entrambi gli emisferi sul lato mediale appena tagliato e usa la lama per fare un taglio parallelo sulla parte superiore dorsale di ciascun emisfero per rimuovere la regione dorsale di ogni pezzo di cervello. Posizionare entrambi gli emisferi sul lato dorsale appena tagliato con la parte ventrale del cervello rivolta verso l'alto e posizionare una goccia di super colla su una piastra per campioni.

Usa la punta di una pipetta per stendere la colla in un'area ampia per accogliere entrambi i pezzi di tessuto e tocca un pezzo di carta da filtro con la cinghia sul lato ventrale di un emisfero. Utilizzare un'altra cinghia di carta da filtro per semi-asciugare accuratamente il lato dorsale del cervello e posizionare il lato dorsale dell'emisfero verso il basso sulla colla sulla piastra del campione. Utilizzare due cinghie di carta da filtro aggiuntive per posizionare il secondo emisfero sulla colla come appena dimostrato e posizionare la piastra del campione nella camera di affettatura.

Quindi coprire rapidamente ma con cura il piatto con una granita di soluzione di fette ad alto contenuto di saccarosio ghiacciata. Per acquisire sezioni di tessuto cerebrale, posizionare la lama del vibratomo davanti al lato mediale degli emisferi e sollevare la tavola del vibratomo in modo che la lama si trovi alla stessa altezza dei lati ventrali degli emisferi, che ora sono rivolti verso l'alto. Utilizzare il controllo del vibratomo per abbassare la lama di 600 micron in direzione dorsale e tagliare il tessuto fino a quando le prime due fette non sono completamente separate dai due emisferi.

Quando le prime due fette di tessuto sono state ottenute, invertire il senso di taglio e abbassare la lama di altri 300 micron prima di affettare nuovamente. Quando l'ippocampo diventa visibile, utilizzare una pipetta di plastica Pasteur allargata per raccogliere e trasferire le fette nella camera di recupero a bagnomaria. Lasciare le fette nella camera di recupero riempita con ACSF per un'ora, quindi posizionare la camera di recupero a temperatura ambiente per 30 minuti prima di eseguire registrazioni elettrofisiologiche dei campioni di tessuto.

Qui si possono osservare registrazioni rappresentative del potenziale post-sinaptico di campo negativo e positivo rispettivamente da fette di bassa e alta qualità. La traccia di esempio negativa mostra un'ampiezza di volée di fibre grandi dopo la depolarizzazione delle fibre neuronali stimolate che è persino superiore all'ampiezza effettiva di fEPSP, mentre la traccia di alta qualità dimostra un rapporto tra volée di fibre piccole e fEPSP e un'elevata ampiezza di fEPSP. La vitalità di una fetta di cervello può anche essere analizzata tracciando le pendenze del potenziale post-sinaptico eccitatorio del campo rispetto alle ampiezze della raffica di fibre.

Le curve di input/output che vengono tipicamente utilizzate per determinare la qualità della fetta possono essere ottenute applicando stimoli di corrente crescenti alla fetta cerebrale e monitorando le successive risposte fEPSP. A causa delle proprietà di conduzione non ottimali del tessuto cerebrale scarsamente conservato, le fette di cervello di bassa qualità dimostrano curve di input/output ridotte. Le fette di cervello vitali hanno linee di base di trasmissione sinaptica stabili, mentre le fette di cervello con una linea di base instabile non possono essere utilizzate per ulteriori protocolli di condizionamento per studiare la plasticità sinaptica dei circuiti cerebrali.

Le registrazioni di base fEPSP possono anche essere utili per monitorare gli effetti dei farmaci sulla trasmissione sinaptica stessa. Inoltre, le fette di cervello possono essere utilizzate in combinazione con un indicatore di calcio per acquisire registrazioni di imaging a fluorescenza e per studiare gli afflussi di calcio in diverse condizioni o trattamenti di fette. Assicurarsi che la dissezione cerebrale venga eseguita entro non più di 1,5 minuti dal sacrificio e questo è ancora la garanzia che il tessuto cerebrale sia solo brevemente privo di raffreddamento e apporto di ossigeno.

Le fette di cervello dell'ippocampo hanno molte applicazioni diverse, dalle tecniche di biologia molecolare all'elettrofisiologia. Questa procedura facilita le intense indagini sull'anatomia dell'ippocampo e sui processi neurologici.