Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo
13 febbraio 2021
L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.
Questo metodo di imaging in vivo delle cellule retiniche consente di indagare sulle malattie oftalmologiche e di comprendere le normali funzioni della retina. Questo metodo fornisce un approccio semplice e altamente riproducibile all'imaging in vivo della retina mediante microscopia a due fotoni. Stabilizzare correttamente il mouse è la chiave per ottenere immagini in vivo di qualità.
Esercitati a posizionare il mouse nel supporto della testa e prendi confidenza con la procedura prima di provare ad acquisire immagini. Sedare l'animale secondo il protocollo di utilizzo degli animali approvato. Applicare la soluzione di dilatazione della pupilla e lasciare il mouse al buio per cinque minuti per consentire alle pupille di dilatarsi.
Fissare il perno del condotto uditivo inferiore nella posizione estesa verso l'interno e il perno del condotto uditivo superiore nella posizione ritirata. Ruotare il braccio principale del supporto della testa fino a quando la barra dell'auricolare non viene inclinata di 60 gradi sotto l'orizzontale. Con il mouse rivolto verso la barra del morso, montare un orecchio sul perno inferiore esteso con il perno inserito nel condotto uditivo.
Dopo aver allentato la vite che fissa il perno del condotto uditivo superiore, estendere il perno nell'altro condotto uditivo e stringere nuovamente la vite per fissare la testa. Assicurarsi che il mouse sia saldamente nel supporto della testina. Premere verso il basso sulla parte superiore della testa.
Il mouse deve rimanere saldamente nelle barre auricolari e la sua testa deve ruotare liberamente attorno all'asse dei canali uditivi. Con la barra del morso posizionata verso la testa del topo, sollevare delicatamente la testa del topo per consentire agli incisivi mascellari di essere abbassati nel supporto della barra del morso e ritrarre la barra del morso con forza delicata per fissare la testa. Utilizzare la vite per fissare la barra del morso in posizione e posizionare il mouse e il supporto sul palco del microscopio.
Applicare colliri lubrificanti su entrambi gli occhi del mouse. Ruotare il braccio principale del supporto della testa fino a quando la pupilla di un occhio è orientata in linea con il percorso della luce e posizionare un coprifiltro numero 1,5 nel portafiltro compatto. Dopo aver fissato il supporto allo stadio del microscopio, abbassare il coprislip fino a quando non entra in contatto con il gel per gli occhi lubrificante senza toccare la cornea e regolare lo stadio nella dimensione X-Y e nella posizione Z dell'obiettivo fino a quando la luce di eccitazione a campo largo copre completamente la cornea.
Utilizzare l'oculare per continuare a regolare la posizione Z fino a quando le cellule fluorescenti o le strutture della retina non vengono messe a fuoco, aumentando l'illuminatore di epifluorescenza se necessario per risolvere singole cellule o strutture di interesse. Ottimizzare l'allineamento della retina con il percorso della luce di imaging. Regolare l'angolo della testa fino a quando non si verifica solo l'espansione o la contrazione della luce sfocata quando si cambia il piano focale, riducendo al minimo le distorsioni X-Y.
Quindi, spegnere l'illuminatore a epifluorescenza e chiudere l'otturatore dell'illuminatore. Per l'imaging a due fotoni, seguire tutti i protocolli di sicurezza laser istituzionali. Spegnere e coprire tutta la luce ambientale e passare il percorso della luce di eccitazione al laser e il percorso della luce di emissione ai PMT.
Nel software di acquisizione immagini, impostare la dimensione del fotogramma su 512 per 512 e la media dei fotogrammi su tre. Impostare lo Z-stepping in modo che inizi dalla parte superiore della pila e progredisca verso il basso, riducendo al minimo l'attivazione laser a due fotoni dei fotorecettori. Accendere e abilitare i PMT e regolare la tensione a 680 volt.
Abilita gli otturatori di imaging ed emissione. Inizia un'anteprima dell'immagine dal vivo del tessuto target, a partire da una potenza laser dell'1%, e regola automaticamente la luminosità del display per visualizzare le cellule o le strutture di interesse. Se il tessuto bersaglio è debole o poco chiaro, aumentare la percentuale di potenza del laser fino a quando le strutture diventano visibili senza superare i 45 milliwatt.
Manovra lo stadio del microscopio nella direzione X-Y per centrare l'area di imaging desiderata e naviga verso il piano Z con le strutture di interesse a fuoco. Per un esperimento time-lapse cronico, aprire un'immagine ottenuta in precedenza da utilizzare come riferimento per le celle di interesse, avendo cura che l'angolo di imaging nell'immagine corrente sia simile a quello delle immagini precedenti. Quindi, passare ai piani Z superiore e inferiore di interesse per impostare i limiti Z dello stack di immagini e acquisire l'immagine.
Quando tutte le immagini sono state acquisite, disattivare i PMT e l'otturatore laser. Passare il percorso della luce di eccitazione all'illuminazione a epifluorescenza e il percorso della luce di emissione all'oculare. Quindi, uscire dal software di acquisizione delle immagini, spegnere il laser nell'interfaccia del computer e spegnere l'hardware in ordine di avvio inverso, ad eccezione dell'apparecchiatura sempre attiva.
Al termine dell'analisi, rimuovere il mouse dal supporto della testa e utilizzare un fazzoletto privo di lanugine per rimuovere delicatamente il gel per gli occhi. Quindi, applicare un unguento oculare lubrificante su entrambi gli occhi e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a circolazione di acqua calda a 37 gradi Celsius con monitoraggio fino a completa recumbency, prima di riportare il mouse nel suo alloggiamento. Nei topi VGlut-2-Cre, i somi delle cellule gangliari retiniche sono chiaramente distinguibili e i fasci assoni sono spesso evidenti.
La traiettoria degli assoni e l'immagine negativa della vascolarizzazione facilitano l'identificazione della testa del nervo ottico nei topi VGlut-2-Cre, che è utile come punto di riferimento negli esperimenti di imaging cronico. In contrasto con le cellule gangliari retiniche, i neuriti delle cellule amacrine sono più spesso osservati negli strati plessiformi interni. Un giorno dopo l'iniezione intraoculare di NMDA, la microglia retinica mostra processi brevi o morfologia ameboide in conformità con i rapporti precedenti.
La somministrazione del colorante blu di Evans tramite una singola iniezione intraperitoneale da 30 a 60 minuti prima dell'imaging induce una forte etichettatura dei vasi sanguigni emanati dalla testa del nervo ottico che persiste per almeno sette giorni. Dopo la fissazione, la vera distanza tra le coppie di cellule all'interno di interi supporti retinici appiattiti può essere misurata in scansioni confocali e abbinata alle distanze dei pixel in vivo per determinare la dimensione media dei pixel delle immagini in vivo. Le microsfere fluorescenti iniettate negli occhi dei topi consentono la misurazione del diametro della microsfera in vivo, fornendo una stima delle dimensioni dei pixel leggermente più grande ma con una maggiore varianza.
L'imaging in vivo può essere abbinato ad analisi istologiche come l'immunocolorazione e l'ibridazione in situ. Questi metodi possono identificare specifici tipi di cellule ed esaminare l'espressione genica delle cellule visualizzate.
Panoramica
Questo studio delinea un protocollo per la condotta di imaging in vivo della retina del topo utilizzando un microscopio a due fotoni, consentendo l'indagine sia della normale funzione retinica che delle malattie oftalmologiche. Evidenzia l'importanza della corretta stabilizzazione del topo per ottenere immagini di alta qualità e discute vari metodi per la marcatura fluorescente dei componenti cellulari all'interno della retina.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Oftalmologia
- Imaging in vivo
Sfondo
- L'imaging in vivo è vitale per comprendere i processi biologici in salute e malattia.
- La retina serve come modello importante per studiare le malattie oculari.
- La microscopia a due fotoni facilita l'imaging ad alta risoluzione di tessuti viventi.
- Il corretto setup e la stabilizzazione del soggetto sono cruciali per un imaging accurato.
Scopo dello studio
- Dimostra un metodo per l'imaging in vivo delle cellule retiniche.
- Fornisce approfondimenti sulla funzionalità delle strutture retiniche e sui meccanismi delle malattie.
- Illustra il processo di marcatura di vari componenti cellulari retinici.
Metodi utilizzati
- La piattaforma principale utilizzata è un microscopio a due fotoni.
- Il modello biologico è la retina del topo, impiegando tecniche per la stabilizzazione cellulare durante l'imaging.
- Nessun flusso di lavoro multiomics è stato menzionato nel testo.
- I passaggi chiave includono la dilatazione della pupilla, la stabilizzazione della testa e i regolazioni focali precise durante l'imaging.
- Le tecniche di marcatura fluorescente sono utilizzate per visualizzare le cellule retiniche.
Risultati principali
- Lo studio dimostra con successo la fattibilità dell'imaging delle cellule gangliari retiniche e delle traiettorie degli assoni in vivo.
- Sono state osservate diverse morfologie cellulari e risposte dopo specifici interventi come l'iniezione intraoculare di NMDA.
- Il protocollo consente l'imaging cronico e la valutazione delle risposte retiniche nel tempo.
- La marcatura dei vasi sanguigni e delle strutture cellulari è stata chiaramente ottenuta, facilitando correlazioni anatomiche e funzionali.
Conclusioni
- Questo protocollo migliora la comprensione della biologia retinica e dei meccanismi alla base delle malattie oculari.
- Consente risultati coerenti e riproducibili nella valutazione degli stati retinici normali e patologici.
- I risultati hanno implicazioni per la ricerca futura sulle malattie retiniche e le terapie.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
In vivo two-photon imaging of the mouse retina enables direct visualization of cellular dynamics in a disease-relevant CNS tissue, supporting target validation and mechanistic de-risking in ophthalmology and neurodegeneration research. The method provides quantitative, reproducible readouts of retinal structure and function, facilitating preclinical assessment of therapeutic candidates. Its applicability to acute and chronic studies allows longitudinal tracking of disease progression and treatment response, informing go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing retinal ganglion cell somas, axon fascicles, and vascular responses in vivo.
- Operational Value: Supports functional target validation through reproducible imaging of cell-specific labeling using AAV, transgenic models, and dyes.
- Predictive Value: Provides mechanistic de-risking by linking structural changes (e.g., microglial morphology post-NMDA) to functional outcomes in disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative outputs such as pixel-to-distance calibration via Evans blue dye or microsphere injection, enabling cross-study comparability.
- Scalability: Compatible with chronic time-lapse experiments using reference images for consistent Z-plane navigation and longitudinal tracking.
- Screening Utility: Prepares validated biological systems for compound evaluation by establishing baseline retinal structure and function in health and disease.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables correlation of in vivo imaging with histological endpoints like immunostaining and in situ hybridization for target engagement validation.
- Disease-Relevant System: Models retinal neurodegeneration and vascular responses applicable to glaucoma, diabetic retinopathy, and neuroinflammatory conditions.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports preclinical go/no-go decisions by quantifying cellular and vascular changes over time in response to intervention.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization to preclinical validation, providing imaging-based biomarkers for retinal structure and function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling longitudinal imaging of retinal cell types and microvascular dynamics.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs through standardized Z-stack acquisition and pixel size calibration.
- Analytics: Enables comparison of conditions via measurable outputs such as cell morphology, axon trajectory, vascular perfusion, and microglial activation states.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through correlative analysis with histological staining and gene expression in imaged retinal cohorts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for multiple retinal cell types and disease models, reducing redundant setup across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in retinal disease models through direct, longitudinal observation.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized head stabilization, pupil dilation, and laser power controls (<45 mW) to minimize variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of target engagement and biological activity, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing structural and functional readouts that correlate with disease progression and therapeutic response.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse handling, two-photon microscopy, and retinal anatomy for proper stabilization and focal alignment.
- Dependent on two-photon laser systems, PMTs, filter sets, and image acquisition software with Z-stepping and shutter control capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of labeling protocols (AAV, transgenic, dye) and imaging parameters to ensure data comparability.
- Adaptation across model systems may require adjustments for pupil size, retinal thickness, and labeling efficiency in non-mouse species or disease models.
- Practical limitations include phototoxicity risk above 45 mW laser power and the need for chronic imaging consistency in head angle and Z-plane referencing.
