Un modello murino di ommaya xenotrapianto per studiare la terapia mirata diretta della malattia leptomeningea

Il Murine Ommaya, che imita il serbatoio di Ommaya utilizzato clinicamente, consente ai ricercatori di testare una varietà di terapie mirate dirette per le metastasi cerebrali e la malattia leptomeningea universalmente fatale in un modello preclinico. Il vantaggio di questa tecnica è che i ricercatori possono fornire un volume di microlitri di farmaci direttamente nel liquido cerebrospinale per trattare le metastasi del sistema nervoso centrale, bypassando la barriera emato-encefalica. Questo protocollo di impianto Murine Ommaya è progettato per ricercatori o tecnici che hanno esperienza di chirurgia stereotassica e formazione tecnica asettica, che sono essenziali per garantire il successo di questa procedura.

A dimostrare la procedura saranno Margie Baldwin e Michelle Danielson di Comparative Medicine presso la University of South Florida e Vincent Law, un ricercatore associato senior del laboratorio del Dr.Peter Forsyth presso il Moffitt Cancer Center and Research Institute. Iniziare iniettando il topo per via sottocutanea con un milligrammo per chilogrammo di buprenorfina a rilascio prolungato. Dopo aver anestetizzato il topo, prepararlo per l'intervento chirurgico.

Tagliare il sito chirurgico con un'area di confine sufficiente per evitare che la pelliccia contamini il sito di incisione. Radere la pelliccia dell'intera superficie della testa e preparare la pelle usando una tecnica sterile. Quindi saturare il sito con antisettico della pelle germicida, lavorando dal centro del sito alla periferia e lasciarlo asciugare.

Posizionare il corpo per garantire che la colonna vertebrale sia mantenuta a livello con la cisterna magna. Mentre si applica una leggera trazione alla coda, posizionare del nastro adesivo alla base della coda per fissarla. Applicare un drappo sterile o un telo di plastica sterile con supporto adesivo per proteggere il sito chirurgico dalla contaminazione.

Con il collo in piena estensione, eseguire le punte chirurgiche a forbice verso il basso con una leggera pressione attraverso l'osso occipitale, iniziando proprio tra le penne. Fai una piccola incisione della linea mediana da tre a cinque millimetri, leggermente sopra la concavità palpata. Aspirare cinque microlitri della sospensione cellulare in una siringa Hamilton calibro 30.

Utilizzare una pinna a punta smussata con una punta da uno a due millimetri per premere delicatamente sulla cisterna magna. Introdurre le punte in posizione chiusa e aprirle mentre si applica una pressione verso il basso sulla dura. Ripetere la dissezione smussata fino a quando la membrana durale è facilmente identificabile e i vasi sanguigni associati sono visibili nell'area esposta.

Tenendo la pinna aperta per ritrarre la muscolatura circostante, introdurre un ago non carotaggio calibro 30 sotto la dura per visualizzare la smussatura, assicurandosi che l'ago venga introdotto solo appena oltre la smussatura stessa. Distribuire lentamente uno stantuffo a siringa e consegnare le celle appena sotto la dura. Se si nota una perdita nel sito di iniezione, applicare una leggera pressione con un applicatore con punta di cotone.

Chiudere la pelle applicando una clip per ferita o una micro goccia di adesivo per la pelle. Monitorare i topi ogni giorno dopo l'intervento chirurgico per la prima settimana. Se un topo sembra essere in dolore o angoscia, trattarlo con un'iniezione sottocutanea di 10 milligrammi per chilogrammo di carprofene una volta ogni 12-24 ore per un massimo di cinque giorni in base alla consultazione veterinaria e alla direttiva.

Assemblare il dispositivo di iniezione Murine Ommaya utilizzando una porta di iniezione miniaturica calibro 25 e un disco distanziatore da un millimetro. Utilizzare un adesivo sterile cianoacrilato per garantire la penetrazione di circa 2,5 millimetri della cannula metallica nell'emisfero cerebrale destro e preparare la pelle secondo la tecnica sterile. Fare una piccola incisione cutanea seguita da dissezione smussata dei tessuti sottocutanei sottostanti per esporre il cranio.

Asciugare il cranio usando bastoncini applicatori con punta di cotone imbevuti di perossido di idrogeno. Praticare un foro di bava di 0,9 millimetri nel cranio di 0,5 millimetri posteriore e 1,1 millimetri laterale del bregma per esporre la materia dura. Spostare il microdrill da parte e segnare delicatamente l'osso immediatamente circostante il foro della bava.

Applicare una porta di iniezione al cranio utilizzando un adesivo sterile cianoacrilato e inserirla a una profondità di circa 2,5 millimetri. Suturare l'incisione utilizzando 4-0 suture di nylon non assorbibili in un modello di punto interrotto o sutura di cordone o incisa. Casa topi post-chirurgici in gabbie individuali per il recupero.

Per dosare il mouse, accedere a Murine Ommaya utilizzando un adattatore per iniezione della porta e una siringa Hamilton. Utilizzando la pinna, tenere premuta la parte superiore della porta di iniezione in miniatura e inserire delicatamente l'adattatore dell'iniettore della porta completamente nel setto della porta. Una volta effettuata l'iniezione, staccare murino Ommaya dall'adattatore di iniezione della porta con una pinna.

Allo scopo di visualizzare il percorso dell'iniezione, 2%Evans Blue è stato iniettato tramite il modello Murine Ommaya. Il colorante si è infiltrato con successo nei ventricoli e nel cervello in 15 minuti. Dopo 30 minuti, il colorante è diventato visibile sul midollo spinale.

Come prova di concetto, i topi BALB / c sono stati iniettati con una linea cellulare di cancro al seno Her2 + TUBO etichettata con luciferasi per via intracisternale e sono stati impiantati gli Ommay murini. Circa una settimana dopo l'iniezione, i topi hanno iniziato a sviluppare LMD. Questi topi sono stati trattati una volta alla settimana per un massimo di quattro settimane con l'immunoterapia con anticorpi Her2, sia attraverso la terapia sistemica tramite iniezione intraperitoneale o per via intratecale tramite Murine Ommaya.

Mentre i topi non trattati sono morti entro il giorno 19, tutti i topi che hanno recuperato la terapia intratecale attraverso l'Ommaya murina sono sopravvissuti. Entro la quarta settimana, è stata osservata una completa regressione dei tumori. Rispetto ai topi trattati con terapia sistemica, i topi che hanno ricevuto la terapia intratecale hanno avuto una sopravvivenza globale molto più lunga.

Quando si tenta questa procedura, è importante che il cranio sia asciutto prima di posizionare l'Ommaya murina. Utilizzare una piccola quantità di colla e posizionare l'Ommaya murina per circa 10 secondi per aderire al cranio. Con questa tecnica, i ricercatori possono esplorare una vasta gamma di farmaci antitumorali in modelli murini che sono clinicamente rilevanti per progettare strategie terapeutiche razionali per i pazienti con metastasi del sistema nervoso centrale.