Monitoraggio in tempo reale della respirazione mitocondriale in cellule T primarie umane graduate differenziate con citochine

Il metabolismo mitocondriale è un regolatore essenziale della durata e della memoria delle cellule T. La misurazione della respirazione mitocondriale fornisce quindi importanti informazioni sulle proprietà delle cellule T. La macchina Seahorse può misurare vari elementi della respirazione mitocondriale, in tempo reale, in linfociti T primari umani vivi, senza la necessità di alcuna etichettatura.

Questo metodo è molto adatto per monitorare la forma fisica delle cellule T e il potenziale di memoria, che sono importanti predittori del successo dell'immunoterapia del cancro. Per iniziare, lavare le perle CD3 / CD28 trasferendo 12,5 microlitri di perline per milione di cellule in un tubo microcentrifuga e aggiungendo 12,5 microlitri di PBS per 12,5 microlitri delle perline nel tubo. Quindi, posizionare il tubo della microcentrifuga su un magnete adatto per un minuto, scartare il tampone e risospesciare le perline nel volume originale del mezzo delle cellule T.

Quindi, aggiungi 12,5 microlitri di perline per milione di cellule in un rapporto tra perline e cellule da uno a due e dividi le cellule in due condizioni con circa cinque milioni di cellule ciascuna. Quindi, aggiungere il volume corretto di citochine a ciascuna condizione e trasferire le cellule su piastre multi-pozzo. Incubare le cellule per tre giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo tre giorni di incubazione, preparare un mezzo di cellule T fresco con il doppio della concentrazione di citochine. Risospesso e dividere le celle trasferendo metà del volume da ciascun pozzo in un nuovo pozzo. Quindi, aggiungere lo stesso volume di mezzo di cellule T appena preparato a ciascun pozzetto.

Per il saggio di flusso extracellulare, preparare una soluzione di rivestimento contenente bicarbonato di sodio, Cell-Tak e idrossido di sodio. Quindi, aprire una piastra di coltura cellulare XF fresca e aggiungere 12 microlitri della soluzione di rivestimento appena preparata a ciascun pozzo, garantendo una distribuzione uniforme della soluzione di rivestimento sul fondo di tutti i pozzetti. Incubare la piastra a temperatura ambiente con il coperchio acceso per 30 minuti.

Quindi, scartare la soluzione liquida rimanente da tutti i pozzetti. Lavare la piastra con 200 microlitri di acqua sterile e scartare il liquido. Quindi, lavare la piastra con 200 microlitri di PBS sterile di grado di coltura cellulare.

Dopo aver scartato il liquido, lasciare asciugare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. Per placcare le cellule T nella piastra di coltura cellulare XF, preparare 50 millilitri di mezzi di saggio mescolando mezzi XF RPMI adatti con glucosio, piruvato e glutammina secondo la configurazione sperimentale. Riscaldare il mezzo preparato a 37 gradi Celsius in un incubatore non regolato dall'anidride carbonica e impostare il pH a 7,4.

Garantire mezzi sufficienti per piantare cellule e preparare le soluzioni di oligomicina e FCCP. Quindi, progettare un layout di piastra con un numero crescente di celle per pozzetto per l'ottimizzazione o l'esecuzione del test. Utilizzare quattro pozzetti pieni di supporti e iniettati con supporti per le misurazioni di fondo.

Dopo aver contato le cellule T preparate in precedenza, pipettare un numero appropriato di cellule a ciascun pozzetto della piastra di coltura cellulare XF precedentemente rivestita in base al layout della piastra. Per far aderire le cellule T alla superficie rivestita, centrifugare la piastra di coltura cellulare XF. Quindi, lavare le cellule con 200 microlitri di mezzi di analisi.

Scartare il supporto e aggiungere 180 microlitri di mezzi di analisi freschi. Dopo essersi assicurati che le cellule siano attaccate e distribuite uniformemente sulla superficie del pozzo, incubare la piastra di coltura cellulare XF a 37 gradi Celsius nell'armadio di riscaldamento non regolato dall'anidride carbonica per 30 minuti. Per l'ottimizzazione, preparare soluzioni di lavoro di oligomicina e FCCP in mezzi di analisi.

Quindi, caricare le soluzioni di lavoro di oligomicina o FCCP nelle porte di iniezione della cartuccia del sensore. Assicurarsi che nessuna porta di iniezione contenga solo aria. Riempire tutte le porte vuote con supporti di analisi.

Quindi, rimuovere le potenziali bolle nelle porte di iniezione battendo delicatamente i bordi della piastra sul tavolo. Per l'esecuzione del test, preparare una soluzione di antimicina A 20 micromolari. Quindi, in base al layout della piastra, caricare 20 microlitri di oligomicina o FCCP nella porta di iniezione A della cartuccia del sensore e aggiungere 22 microlitri di antimicina A alla porta di iniezione B di tutti i pozzetti.

In un'ottimizzazione rappresentativa dell'oligomicina, un plateau nel tasso di consumo di ossigeno, o OCR, viene raggiunto quando la concentrazione accumulativa raggiunge un micromolo. Da questa concentrazione in poi, l'OCR non è stato ulteriormente ridotto. Per le cellule trattate con concentrazioni crescenti di FCCP disaccoppiatore, i livelli di OCR sono aumentati fino a 0,2 FCCP micromolari e poi hanno raggiunto un plateau, indicando che è stato ottenuto il disaccoppiamento completo.

In un'esecuzione rappresentativa di ottimizzazione della concentrazione cellulare, l'OCR iniziale per una corsa con 200.000 celle è circa la metà di quella, con 400.000 celle. Dopo il trattamento FCCP, l'OCR massimo è di 61,6 picomoli al minuto per 200.000 cellule e 190,4 picomoli al minuto per 400.000 cellule. Dopo il trattamento con oligomicina, l'OCR in esecuzione con 200.000 cellule collassa in singole cifre ed è inferiore a quello in esecuzione con 400.000 cellule.

Studiando l'effetto delle citochine interleuchina-2 e interleuchina-15 sul metabolismo delle cellule T ha rivelato che le cellule coltivate di interleuchina-15 possedevano una respirazione massima più elevata e una capacità respiratoria di riserva. Tuttavia, la respirazione basale e la produzione di ATP non sono state influenzate. Lo studio del metabolismo mitocondriale nelle cellule T umane fornisce importanti indizi sulla loro durata e potenziale di sopravvivenza.

Ciò si traduce in una maggiore conoscenza del fitness delle cellule T e può in definitiva migliorare i tassi di risposta all'immunoterapia del cancro.