Name: Riattivazione delle cellule staminali neurali negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Scopri come riattivare le cellule staminali neurali quiescenti in espianti cerebrali di Drosophila in coltura. Questo metodo permette di studiare i segnali sistemici e intrinseci che regolano la quiescenza e la riattivazione dei neuroblasti.

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Riconosciamo il programma LSAMP Bridges to Doctorate for funding (CNK) e NIH / NIGMS (R01-GM120421 e R35-GM141886). Siamo grati al Dr. Conor Sipe per la Figura 1. Ringraziamo anche tutti i membri del laboratorio Siegrist per il loro continuo supporto e tutoraggio. Ringraziamo in particolare Chhavi Sood e Gary Teeters per l'attenta lettura del manoscritto e per aver fornito commenti.

<ol><li>Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+clinical+applications+of+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).</li>
<li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine%3A+challenges+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+the+evolving+notion+of+cellular+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem cells and the evolving notion of cellular identity.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376(2015).</li>
<li>Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+A+cellular+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Wound healing: A cellular perspective.</a> Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).</li>
<li>van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+quiescence%3A+Dynamism%2C+restraint%2C+and+cellular+idling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling.</a> Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).</li>
<li>Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+coordination+of+T+cell+quiescence+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic coordination of T cell quiescence and activation.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).</li>
<li>Wosczyna, M. N., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+muscle+stem+cell+support+group%3A+Coordinated+cellular+responses+in+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration.</a> Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li>
<li>Kang, K. H., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neural+stem+cell+self-renewal+and+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila.</a> Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).</li>
<li>Chell, J. M., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition-responsive+glia+control+exit+of+neural+stem+cells+from+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence.</a> Cell. 143, 1161-1173 (2010).</li>
<li>Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+cells+reactivate+quiescent+neuroblasts+via+TOR+and+glial+insulin+relays+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila.</a> Nature. 471, 508-512 (2011).</li>
<li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila%3A+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremes+of+lineage+plasticity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain.</a> Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).</li>
<li>Sipe, C. W., Siegrist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyeless+uncouples+mushroom+body+neuroblast+proliferation+from+dietary+amino+acids+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila.</a> Elife. 6, 26343(2017).</li>
<li>Speder, P., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+and+local+cues+drive+neural+stem+cell+niche+remodelling+during+neurogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila.</a> Elife. 7, 30413(2018).</li>
<li>Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dilp-2-mediated+PI3-kinase+activation+coordinates+reactivation+of+quiescent+neuroblasts+with+growth+of+their+glial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche.</a> PLoS Biology. 18, 3000721(2020).</li>
<li>Colombani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li>
<li>Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+insulin+secretion+by+fat+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culturing+of+whole%2C+developing+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270(2012).</li>
<li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094(2020).</li>
<li>Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+neuroblast+proliferation+in+explant+culture+of+the+Drosophila+larval+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS.</a> Brain Research. 818, 77-83 (1999).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi in competizione.

Il metodo qui descritto per coltivare gli espianti cerebrali può essere eseguito nella maggior parte degli ambienti di laboratorio. Gli strumenti richiesti, così come la procedura e la raccolta dei dati, sono semplici e diretti. Con questo metodo, si può testare una varietà di ipotesi, comprese quelle relative alle cascate di segnalazione cellulare e ai fattori estrinseci che regolano la riattivazione e la proliferazione nb. Qui, utilizzando animali OregonR selvatici, abbiamo scoperto che l'insulina esogena era sufficien...

Le cellule staminali sono di grande interesse per il loro potenziale di utilizzo nella medicina rigenerativa 1,2. Molti animali, specialmente quelli longevi, mantengono le cellule staminali all'interno dei loro tessuti adulti. Queste cellule staminali residenti funzionano per mantenere l'omeostasi tissutale e sono utilizzate per la riparazione a seguito di lesioni fisiche o malattie 3,4. La maggior parte delle cellule staminali negli animali adulti sono quiescenti, uno stato relativamente dormiente caratterizzato dall'arresto del ciclo cellulare e dall'inattivazione della segnalazione della crescita5. In risposta a segnali estrinseci, le cellule staminali escono dalla quiescenza, entrano nel ciclo cellulare e iniziano a generare progenie figlia specifica per il loro tipo di tessuto. Ad esempio, al fine di montare una risposta immunitaria efficace, le cellule che presentano l'antigene inducono cellule T ingenue quiescenti ad entrare nel ciclo cellulare e ad espandersi clonalmente6. In risposta al danno muscolare scheletrico, le cellule staminali satelliti muscolari entrano nel ciclo cellulare e generano mioblasti figli per sostituire le miofibrille danneggiate 5,7. Mentre è chiaro che le cellule staminali quiescenti rispondono ai segnali estrinseci, in molti casi, la natura del segnale estrinseco rimane poco chiara, così come il meccanismo di attivazione delle cellule staminali indotte dal cue. Ottenere una migliore comprensione di come le cellule staminali quiescenti rispondono ai segnali estrinseci ed entrano nel ciclo cellulare aiuterà nello sviluppo di migliori terapie con cellule staminali nella clinica e aumenterà le conoscenze scientifiche.
Per decenni, gli organismi modello sono stati utilizzati per scoprire i geni e le vie di segnalazione cellulare che regolano la proliferazione delle cellule staminali durante lo sviluppo e in età adulta. In Drosophila, le cellule staminali neurali (NSC), note come neuroblasti (NB), si dividono durante lo sviluppo per generare tutti i neuroni e glia che alla fine si integrano, formando il circuito neurale richiesto per la funzione cerebrale 8,9. Come altre cellule staminali, le NB si dividono asimmetricamente per auto-rinnovarsi e, in alcuni casi, simmetricamente per espandere il pool di cellule staminali. I NB sono specificati durante l'embriogenesi e la maggior parte entra in quiescenza verso la fine, in coincidenza con il declino delle riserve di nutrienti materni (Figura 1). Dopo che l'embriogenesi è completa, le larve si schiudono e iniziano a nutrirsi. In risposta all'alimentazione animale, i NB si riattivano dalla quiescenza e riprendono le divisioni cellulari 10,11,12,13,14,15,16. Poiché il SNC Di Drosophila è relativamente semplice e poiché i NB entrano ed escono dalla quiescenza in momenti definiti, l'uso di Drosophila per studiare la regolazione della quiescenza, dell'entrata e dell'uscita, si rivela ideale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63189/63189fig01.jpg"> Figura 1: Proliferazione relativa di CB NB (neuroblasti cerebrali centrali, rosso) e MB NB (neuroblasti del corpo a fungo, blu) nel corso dello sviluppo. Alla fine dell'embriogenesi, la maggior parte dei NB (linea rossa) cessa la proliferazione ed entra nella quiescenza. La quiescenza continua fino a quando le larve appena schiuse consumano il loro primo pasto completo. I punti temporali di messa a fuoco per questa metodologia sono indicati in cerchi rossi (1, quiescenza e 2, riattivazione). Gli MB NB (blu) sono un sottoinsieme di NB del cervello centrale che si dividono continuamente durante lo sviluppo (4 per emisfero cerebrale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63189/63189fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In risposta all'alimentazione animale, le vie di segnalazione della crescita PI3-chinasi e TOR diventano attive nei NB e nella loro nicchia gliale e tracheale 10,11,15,16. Quando i nutrienti dietetici vengono ritirati o quando i livelli di PI3-chinasi sono ridotti, i NB non riescono a riattivarsi e anche la crescita di glia e trachea viene ridottadi 10,11,15,16. Il modello attuale postula che la riattivazione nb sia accoppiata alla crescita larvale da parte del corpo grasso, che rilascia un segnale sistemico in risposta all'alimentazione animale 12,17,18. Questo segnale, che rimane sfuggente, probabilmente promuove l'espressione e il rilascio del peptide insulino-simile alla Drosophila (Dilps) nel cervello, che porta all'attivazione a valle della PI3-chinasi nei NB e nella loro nicchia gliale e tracheale. Per comprendere meglio la natura dei segnali sistemici, abbiamo sviluppato un metodo per riattivare i NB quiescenti negli espianti cerebrali in coltura. Con questo metodo, la riattivazione dei NB può essere analizzata in assenza di segnali sistemici di animali interi. I fattori esogeni possono essere riforniti ai terreni di coltura e la riattivazione NB è stata analizzata in base all'incorporazione dell'analogo della timidina, EdU. Utilizzando questo metodo, abbiamo determinato che l'insulina esogena è sufficiente per riattivare i NB quiescenti negli espianti cerebrali. Il lavoro futuro sarà finalizzato all'identificazione di ulteriori fattori che, una volta aggiunti, regolano positivamente o negativamente la quiescenza NB negli espianti cerebrali.

<table><tbody><tr><td>10 &micro; L Puntali per pipette</td><td>Denville Sci</td><td>P2102</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Puntali per pipette</td><td>Denville Sci</td><td>P2103-N</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Pipettor</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldeide (10 x 10 mL)</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>2912.60.0000</td><td>Utilizzato per la fissazione di cervelli larvali</td></tr><tr><td>20 &; L Pipetta</td><td>Gilson</td><td>P20</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro; L Puntali per pipette</td><td>Denville Sci</td><td>1158U56</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura multipozzetto a 24 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-197-4477</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Petri da 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>Piastra per uva Ingredienti</td></tr><tr><td>4 gradi Frigorifero C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Fornisce una temperatura ideale per incubazioni di >24 ore in soluzione anticorpale</td></tr><tr><td>63x Obiettivo</td><td>Lecia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lievito secco attivo</td><td>La maggior parte dei supermercati</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td>Ingredienti del piatto d'uva</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Kit di proliferazione cellulare per l'imaging, Alexa Fluor 647 colorante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td>per etichettare le cellule proliferanti</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 22 mm x 22 mm x 1 mm , confezione da 10 da 4 oz</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>Due vetrini coprioggetti sono super incollati alle estremità del vetrino del microscopio. Questo crea uno spazio che consente ai cervelli di fluttuare in antidissolvenza durante l'immagine.</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti, 22 mm x 50 mm x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td>Il vetrino coprioggetti viene posizionato su due vetrini coprioggetti quadrati sul vetrino del microscopio, assicurando che il cervello nell'antidissolvenza non si muova durante l'imaging.</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, bottiglia da 1 gallone</td><td>Fisher Scientific</td><td>2701</td><td>Utilizzato per lavare via le larve prima della tenuta di 24 ore nel terreno di coltura</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (10%)</td><td>Sigma</td><td>F4135-100ML</td><td>Integratore per terreni di coltura cellulare.</td></tr><tr><td>Pinze fini per la dissezione</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>11295-20</td><td>Forcepts utilizzati nelle dissezioni. Funzionano meglio se affilati.</td></tr><tr><td>Bottiglie per Incrocio</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-130</td><td>Questa bottiglia viene utilizzata come contenitore che permette alle mosche di deporre le uova sul piatto d'uva.</td></tr><tr><td>Piatto di dissezione in vetro (3 pozzetti)</td><td>Questi non sono più disponibili</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutatione</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td>Fornisce protezione ossidativa durante la coltura cellulare.</td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma</td><td>G9023- 10ML</td><td>Agente bloccante</td></tr><tr><td>Piastre d'uva</td><td>Fatto in casa</td><td>Fatto in casa</td><td>Piastre di succo d'uva/agarosio per la raccolta di uova appena schiuse</td></tr><tr><td>Immagine J</td><td>Imagej.net/fiji/downloads</td><td>Download gratuito:&nbsp; https://fiji.sc</td><td>Piattaforma di imaging che viene utilizzata per contare le cellule e la riattivazione Edu</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Assicura che la temperatura, l'umidità e l'esposizione alla luce siano esattamente le stesse durante l'esperimento.</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>Variabile indipendente dell'esperimento</td></tr><tr>Cappa <td></td><td></td> a<td>flusso laminare</td><td>Per l'aliquotazione di terreni di coltura</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Fornisce supporto durante la coltura cellulare</td></tr><tr><td>Nunc Mini vassoi Microwell a 72 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-154</td><td>Le fasi di immunocolorazione vengono eseguite in questo vassoio</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>Film utilizzato per sigillare le piastre al fine di prevenire l'evaporazione</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma</td><td>P4458-100ml</td><td>Antibiodics utilizzato per prevenire la contaminazione batterica delle cellule durante la coltura.</td></tr><tr><td>Tampone fosfato, pH7.4</td><td>Prodotto in casa</td><td>Prodotto in casa</td><td>Solvente utilizzato per lavare il cervello dopo le fasi di fissaggio e colorazione</td></tr><tr><td>Pick</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td>Utilizzato per raccogliere le larve dal piatto d'uva</td></tr><tr><td>Acido propionico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-258</td><td>Ingredienti del piatto d'uva</td></tr><tr><td>Coniglio 405</td><td>Abcam</td><td>ab175653</td><td>Anticorpi utilizzati per l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>Rat 555</td><td>Abcam</td><td>ab150166</td><td>Anticorpi utilizzati per l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>Rb Scribble</td><td>Un regalo da Chris Doe</td><td></td><td>Anticorpi utilizzati per l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>Rt Deadpan</td><td>Abcam</td><td>ab195173</td><td>Anticorpi utilizzati per l'immunocolorazione</td></tr><tr><td>Schneiders Culture Medium</td><td>Life Tech</td><td>21720024</td><td>Contiene sostanze nutritive che aiutano le cellule a crescere e proliferare</td></tr><tr><td>SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL)</td><td>Life Tech</td><td>S36963</td><td>Reagente che fornisce protezione contro lo sbiadimento dei fluorofori</td></tr><tr><td>Acqua sterile</td><td>Autoclave Acqua Milli-Q prodotta in casa</td><td></td><td>Necessario per le soluzioni</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher</td><td>S2-12</td><td>Ingredienti Vetrini</td></tr> per <tr><td>microscopio Superfrost</td> Fisher <td>Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Supercolla</td><td>La maggior parte dei supermercati</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td>Ingredienti del piatto d'uva</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284-100ML</td><td>PBT</td></tr><tr><td>Welch's 100% succo d'uva d'uva</td><td>La maggior parte dei supermercati</td><td></td><td>Ingredienti del piatto d'uva</td></tr></tbody></table>

riattivazione delle cellule staminali neurali negli espianti cerebrali di drosophila in coltura

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

Le cellule staminali neurali (NSC) hanno la capacità di proliferare, differenziarsi, subire apoptosi e persino entrare e uscire dalla quiescenza. Molti di questi processi sono controllati dalla complessa interazione tra i programmi genetici intrinseci NSC con i fattori estrinseci NSC, locali e sistemici. Nell'organismo modello genetico, Drosophila melanogaster, le NSC, note come neuroblasti (NB), passano dalla quiescenza alla proliferazione durante la transizione embrionale a quella larvale. Durante questo periodo, le larve emergono dai loro gusci d'uovo e iniziano a gattonare, alla ricerca di nutrienti dietetici. In risposta all'alimentazione animale, il corpo grasso, un organo endocrino con capacità di accumulo lipidico, produce un segnale, che viene rilasciato sistemicamente nell'emolinfa circolante. In risposta al segnale derivato dal corpo grasso (FBDS), i peptidi insulino-simili a Drosophila (Dilps) vengono prodotti e rilasciati dai neuroni neurosecretori del cervello e dalla glia, portando all'attivazione a valle della segnalazione della crescita della PI3-chinasi nei NB e nella loro nicchia gliale e tracheale. Sebbene questo sia il modello attuale di come i NB passano dalla quiescenza alla proliferazione, la natura del segnale estrinseco FBDS rimane sfuggente. Per capire meglio come i segnali sistemici estrinseci NB regolano l'uscita dalla quiescenza, è stato sviluppato un metodo per coltivare i primi cervelli larvali in vitro prima dell'alimentazione animale. Con questo metodo, i fattori esogeni possono essere forniti ai terreni di coltura e NB uscita dalla quiescenza analizzata. Abbiamo scoperto che l'insulina esogena è sufficiente per riattivare i NB dalla quiescenza negli espianti di tutto il cervello. Poiché questo metodo è adatto per schermi su larga scala, miriamo a identificare ulteriori segnali estrinseci che regolano la quiescenza NB rispetto alle decisioni di proliferazione. Poiché i geni e i percorsi che regolano le decisioni di proliferazione NSC sono conservati evolutivamente, i risultati di questo test potrebbero fornire informazioni sul miglioramento delle terapie rigenerative nella clinica.

I cervelli selvatici dell'OregonR appena nati sono stati sezionati e coltivati per 24 ore nei media di Schneider integrati (SSM) con insulina. I tessuti sono stati fissati e macchiati secondo il protocollo. Sono stati utilizzati anticorpi primari generati contro Deadpan (Dpn) per rilevare NB e Scribble per etichettare le membrane cellulari. L'analogo della timidina 5-etinil-2′-deossiuridina (Edu) è stato aggiunto per rilevare l'ingresso nella fase S e la riattivazione NB. Abbiamo trovato NB Edu positivi e Dpn positivi di...

È stato stabilito un metodo per riattivare le cellule staminali neurali quiescenti negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura. Utilizzando questo metodo, il ruolo dei segnali sistemici può essere disaccoppiato dai segnali intrinseci del tessuto nella regolazione della quiescenza, dell'ingresso e dell'uscita delle cellule staminali neurali.

Riattivazione delle cellule staminali neurali negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes ...

Abbiamo sviluppato un metodo per riattivare le cellule staminali neurali quiescenti negli espianti cerebrali di drosophila in coltura. Questo metodo può fornire fattori esogeni ai terreni di coltura e può testare la riattivazione dei neuroblasti. Migliori terapie con cellule staminali potrebbero essere sviluppate da una migliore comprensione di come le cellule staminali quiescenti rispondono ai segnali estrinseci ed entrano nel ciclo cellulare.A dimostrare la procedura sarà Susan Doyle, ricercatrice del mio laboratorio. Per iniziare con attenzione raccogliere circa 20-25 larve appena nate dalla piastra di agar d'uva sotto un microscopio di dissezione. Riempire una capsula di Petri con circa due millilitri di PBS e immergere la punta dello strumento contenente larve in PBS per due minuti.Dopo due minuti, capovolgere il piatto ad angolo per raggruppare il liquido sul fondo e, usando un piccolo pennello, spazzolare le larve dal liquido sul fondo della capsula di Petri. Raccogliere tutte le larve sul pennello e risciacquare brevemente le larve con il 70% di etanolo prima di trasferirle nella capsula di Petri contenente PBS. Spruzzare l'area di lavoro, gli strumenti di dissezione, la pinza e due piatti in vetro con etanolo al 70% e lasciarli asciugare sul banco.Prepara il terreno di coltura integrato di Schneider, o SSM, e mettilo sul ghiaccio. Pipettare un millilitro del mezzo in ogni piatto di vetro. Utilizzando una micropipetta con una punta sterile, trasferire le larve appena schiuse dalla piastra di PBS all'SSM nel primo piatto di vetro.Seziona il cervello dalle larve poste nella seconda parabola di vetro con SSM usando una pinza sotto un microscopio di dissezione e regolando l'ingrandimento secondo necessità. Usa una pinza per afferrare i ganci della bocca e, con l'altra, afferra delicatamente il corpo a metà strada e tira nella direzione opposta per dividere la larva in due pezzi. Dopo aver sezionato da 15 a 20 cervelli, aggiungere un millilitro di SSM in un pozzo di un vassoio di coltura sterile a 24 pozzetti.Usando una micropipetta e una punta sterile, trasferire i cervelli appena sezionati nell'SSM, seguiti dall'incubazione dei media con il cervello per 24 ore a 25 gradi Celsius. Pipettare 10 microlitri di uno stock di 10 millimolari di 5-etinil-2'deossiuridina, o EDU, con 990 microlitri di SSM in un tubo microcentrifuga sterile, mescolare, quindi pipettare un millilitro di EDU SSM in un pozzo del vassoio di coltura sterile a 12 pozzetti. Trasferire il cervello utilizzando una micropipetta con una punta sterile dal pozzo contenente SSM al nuovo pozzo contenente la soluzione EDU SSM e incubare per un'ora a 25 gradi Celsius.Quindi, trasferire i cervelli etichettati EDU in un altro pozzo nello stesso vassoio di coltura contenente un millilitro di fissativo e consentire al cervello di essere fissato per 20 minuti. Dopo la fissazione, trasferire rapidamente il cervello in un minitray pozzetto a 72 pozzetti usando una micropipetta. Risciacquare il cervello tre volte in 10 microlitri di PBT e ripetere tre lavaggi per 10 minuti ciascuno, assicurandosi che i cervelli siano sempre coperti da del liquido.Pipetta 10 microlitri di soluzione bloccante sul cervello. Coprire il vassoio e sigillarlo con una striscia di parafilm attorno al bordo. La figura mostra cellule neuroblasti EDU-positive e deadpan-positive di grandi dimensioni dopo 24 ore di coltivazione in SSM con insulina e colorazione.Dopo 24 ore nel media integrato di Schneider senza insulina, i cervelli di tipo selvaggio dell'Oregon R appena nati non avevano cellule neuroblasti EDU-positive e deadpan-positive di grandi dimensioni, a parte le cellule neuroblasti a quattro funghi e una cellula neuroblastica ventrolaterale. Durante l'imaging confocale, alcuni emisferi cerebrali con danni, come fori di piccole e grandi dimensioni nel tessuto cerebrale espiantato, sono stati occasionalmente osservati. Eventuali cervelli con buchi non sono stati utilizzati per l'analisi.Sezionare i tessuti con cura e pipettare delicatamente per evitare danni ai tessuti. Cerca anche di essere il più sterile possibile e non contaminare le tue culture. Poiché i terreni di coltura possono essere facilmente manipolati aggiungendo diversi fattori, questa tecnica può essere utilizzata per affrontare ipotesi future riguardanti la segnalazione estrinseca e l'ingresso e l'uscita della quiescenza dei neuroblasti.

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Questo video dimostra la preparazione di colture primarie neuronali dal cervello di fine tappa Drosophila pupe. Visto di culture live show crescita dei neuriti e l'imaging di livelli di calcio con Fura-2.

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Ex coltura vivo di Whole, in via di sviluppo Brains Drosophila

Questo video dimostra un protocollo per identificare i fattori esogeni che avviano la riattivazione delle cellule staminali neurali cerebrali di Drosophila dal loro stato quiescente. Le larve appena nate vengono sezionate per isolare il loro cervello, che viene poi coltivato in terreni con o senza un ormone di prova per valutare il potenziale dell'ormone di indurre la riattivazione e la proliferazione delle cellule staminali neurali.

Analisi della riattivazione delle cellule staminali neurali negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura

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Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em&gt; Drosophila</em

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Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

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Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery

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