In vivo Letture di lesioni vascolari nella retina del topo per promuovere la riproducibilità

Qui, presentiamo tre protocolli di analisi dei dati per l'angiografia fluoresceina (FA) e le immagini di tomografia a coerenza ottica (OCT) nello studio dell'occlusione venosa retinica (RVO).

Questo protocollo consente all'utente di misurare quantitativamente marcatori clinicamente analoghi di danno nell'imaging retinico del topo, il che rafforza la traducibilità dei risultati successivi. Questi metodi ci consentono di semplificare l'analisi e ci danno la possibilità di confrontare in modo affidabile l'imaging tra animali da esperimento. Mentre questi metodi sono stati sviluppati per studiare una panoramica del modello murino, possono facilmente estendersi alla ricerca su qualsiasi malattia della retina che utilizza le stesse tecniche di imaging.

Accendere la scatola luminosa del microscopio per l'imaging retinico, la macchina per la tomografia a coerenza ottica e la piattaforma riscaldata del mouse. Accendere il computer e aprire il programma di imaging. Aggiungere una goccia di fenilefrina e tropicamide a ciascun occhio.

Iniettare 100 microlitri di fluoresceina all'1% per via intraperitoneale. Posizionare il mouse sulla piattaforma. Regolare l'altezza e l'angolazione della piattaforma fino a quando la vista del fondo retinico è chiara e focalizzata.

Scatta una foto del fondo. Aprire il software di imaging e tomografia a coerenza ottica. Nel programma di tomografia a coerenza ottica regolare nudge a 10.

Prendere un'immagine di tomografia a coerenza ottica, aggiungere 75 micrometri distali dalla bruciatura. Ripetere per gli altri tre quadranti della retina. Passare la fotocamera a un filtro a 488 nanometri.

Aumentare il guadagno della fotocamera a 5. Scatta una foto del fondo esattamente 5 minuti dopo l'iniezione di fluoresceina. Aprire l'immagine della fluoresceina sul software di elaborazione delle immagini.

Duplicare l'immagine. Utilizzando uno strumento di selezione, tracciare attentamente le navi principali. Ignorare tutte le navi che si diramano da queste navi.

Nella prima immagine, eliminare la selezione, lasciando solo il vaso. Salva questa immagine mascherata. Spostate la selezione sulla seconda immagine, invertite la selezione ed eliminate, isolando lo sfondo.

Salva questa immagine mascherata. Aprire l'immagine di sfondo e misurare la densità integrata. Apri l'immagine dei vasi, seleziona il contorno dei vasi e quindi misura l'intensità media.

Dividere la densità integrata dello sfondo per l'intensità media dei vasi, generando il rapporto di perdita per l'occhio. Registrare questo rapporto di perdita per ciascun occhio in una coorte sperimentale. Per controllare ulteriormente lo sfondo, normalizzare gli occhi sperimentali al rapporto medio di perdita degli occhi di controllo illesi.

Aprire l'immagine della tomografia a coerenza ottica nel software di elaborazione delle immagini. Traccia i bordi dello strato di cellule ganglionari, dello strato plessiforme interno, dello strato nucleare interno, dello strato plessiforme esterno, dello strato fotorecettore e dello strato RPE. Esporta i file come CSV.

Misurare lo spessore medio di ogni strato e ripetere per ciascun occhio nella coorte sperimentale. Aprire l'immagine della tomografia a coerenza ottica nell'immagine J.Utilizzando lo strumento linea, misurare la distanza in cui il bordo superiore dello strato plessiforme esterno è indistinto. Misurare orizzontalmente, mantenendo la latitudine in cui inizia la disorganizzazione.

Calcola la somma delle distanze disorganizzate nell'immagine. Dividere la lunghezza della disorganizzazione per la lunghezza totale della retina per ottenere il rapporto di disorganizzazione. Ripetere la misurazione e il calcolo per le immagini di tomografia a coerenza ottica dagli altri tre quadranti della retina.

Prendi la media dei rapporti di disorganizzazione dalle quattro immagini di tomografia a coerenza ottica. Questo numero rappresenta la disorganizzazione media per l'intera retina. Ripetere l'operazione per ciascun occhio nella coorte sperimentale.

Le immagini mascherate utilizzate per il calcolo del rapporto di perdita per ogni immagine retinica possono essere confrontate con altre e analizzate, separando la vascolarizzazione maggiore da altre aree della retina. La quantificazione della fluoresceina consente il confronto della gravità della lesione e dell'efficacia del trattamento, nonché lo studio dei cambiamenti nelle perdite nel corso del tempo della lesione. Si osserva una delineazione degli strati della retina in un'immagine OCT.

La quantificazione dello spessore per ogni strato retinico mostra che la risposta edematosa iniziale ha un effetto più profondo sugli strati retinici interni. Dall'analisi di un decorso temporale del danno occlusivo venoso retinico, si può osservare l'iniziale gonfiore infiammatorio degli strati retinici e l'eventuale assottigliamento degenerativo. Lo strato nucleare interno sperimenta una risposta molto maggiore alla lesione iniziale, ma lo strato plessiforme interno mostra un assottigliamento più grave dopo che l'edema iniziale è stato stabilizzato e ritorna al basale.

La disorganizzazione dello strato retinico interno si manifesta come una scomparsa del limite superiore dello strato plessiforme esterno, fondendo insieme gli strati plessiformi esterni e nucleari interni. La disorganizzazione retinica di due gruppi sperimentali è stata confrontata per studiare l'efficacia di un inibitore nel mitigare il danno retinico. La qualità dell'immagine è di vitale importanza per la qualità dell'analisi.

Quando acquisisci immagini retiniche, prenditi il tempo necessario per assicurarti che il fondo oculare e gli strati retinici siano il più chiari e focalizzati possibile. Questi metodi non invasivi possono essere utilizzati longitudinalmente e in combinazione con lo studio biochimico e immunoistochimico del tessuto per creare profili di malattia più sfaccettati e dettagliati. Questa tecnica consente la quantificazione affidabile dei dati di imaging retinico in vivo in modelli di malattia neurovascolare in modo che i dati possano essere più facilmente tradotti in malattie umane.