Nozioni di base sull'istologia e rilevamento della morte cellulare nel tessuto delle api

I metodi immunoistochimici sono utili nella ricerca sulle api per rilevare e valutare il livello di apoptosi e necrosi nell'intestino medio e nelle ghiandole ipofaringee delle api adulte.

Questo protocollo è utile in molti studi biologici e tossicologici sulle api trattate con pesticidi. Aiuta a rilevare le risposte cellulari del tessuto delle api degli acaricidi che vengono utilizzati nelle colonie di api per il trattamento contro gli acari Varroa. È un potente strumento per la rilevazione di piccoli effetti sui tessuti in combinazione con il comportamento delle api o di altri insetti utili.

Per iniziare, prendi con attenzione un'ape operaia con una pinza e mettila sul ghiaccio o sul congelatore a meno 20 gradi Celsius per due minuti per immobilizzarla. Appuntare l'ape sulla piastra di Petri diagonalmente attraverso la parte posteriore superiore del torace due volte da sinistra a destra e da destra a sinistra. Povero insetto salino per coprire il corpo.

Posizionare la capsula di Petri sotto lo stereomicroscopio, mettere a fuoco e regolare. Per sezionare l'intestino medio, inizia con l'addome inserendo un punto delle forbici sotto il tergite A5 al centro del lato destro del corpo dell'ape. Tagliare al tergite A2. Tenere la lama interna delle forbici parallela al lato del corpo per evitare di danneggiare gli organi interni.

Girare le forbici a sinistra e tagliare. Apri delicatamente la parte sinistra dell'addome e fissala. Usando una pinza con una mano, tirare delicatamente lo stomaco delle api verso l'alto e con le forbici nell'altra mano, tagliare alla fine dell'esofago.

Tirare lo stomaco e l'intestino medio lontano dall'addome e tagliare il retto. Utilizzare una pipetta con soluzione salina di insetti e rimuovere eventuali feci o parti del tessuto. Per la dissezione delle ghiandole ipofaringee, immobilizzare un'ape operaia sul ghiaccio come descritto prima.

Tagliare la testa e posizionarla su una piastra più piccola con l'antenna rivolta verso l'alto. Fissare la testa con due perni, uno attraverso l'occhio composto sinistro e il secondo attraverso l'occhio composto destro. Fai un taglio attraverso il primo occhio composto sul lato interno dei perni, continua fino al labbro e poi fai un altro taglio sull'altro lato attraverso il secondo occhio composto.

Tagliare le antenne. Togliere la maschera e tagliare dove ancora attaccato. Prendi la pinza e rimuovi con attenzione le ghiandole insieme al cervello e parte degli occhi composti.

Per la colorazione dell'ematossilina e dell'eosina, mettere le sezioni decerate e reidratate in ematossilina per cinque minuti. Quindi, posizionali con cura sotto l'acqua corrente del rubinetto per due minuti. Quindi, metterli in acqua distillata per un minuto e eosina per quattro minuti.

Posizionare i vetrini al 96% di etanolo per un minuto, quindi il 2-propanolo per due minuti e infine nell'agente di compensazione per due minuti. Aggiungere il mezzo di montaggio e un bicchiere di copertura e lasciarli asciugare. Osservare al microscopio ottico.

Preparare i barattoli Coplin. Preparare la proteinasi-K. Dopo aver decerato e reidratato le sezioni, posizionare i vetrini in PBS per cinque minuti.

Posizionare i vetrini in piano nel contenitore e aggiungere proteinasi-K. Lavare gli scivoli in acqua distillata. Estinzione in perossidasi endogena a temperatura ambiente.

Risciacquare i vetrini con PBS o acqua. Posizionare i vetrini in piano nel contenitore e applicare il buffer di equilibrio per 10 secondi a temperatura ambiente. Dopo aver pulito il tessuto, aggiungere l'enzima desossinucleotidil transferasi terminale a ciascuna sezione e incubare in una camera umidificata per un'ora a 37 gradi Celsius.

Prima dell'incubazione, mettere asciugamani di carta inumiditi all'interno del vassoio attorno ai vetrini e coprirli con pellicola trasparente. Dopo l'incubazione, mettere i campioni sul rack e lasciarli in tampone stop-wash. Dopo aver lavato i vetrini in PBS e asciugato intorno ai tessuti, aggiungere due gocce di anti-digoxigenina perossidasi coniugata calda alle sezioni e incubare per 30 minuti in un contenitore umidificato.

Dopo il lavaggio in PBS, preparare il substrato di forza di lavoro-perossidasi, coprire le sezioni con substrato di perossidasi e colorare per cinque minuti. Posizionare il vetrino sotto il microscopio e determinare il tempo di colorazione ottimale. Dopo aver lavato i vetrini in uno stendibiancheria e acqua distillata, incubare i vetrini in acqua distillata per cinque minuti.

Contro-macchia con ematossilina per due minuti. Lavare i vetrini mettendoli sotto l'acqua corrente del rubinetto per tre minuti e poi in acqua distillata. Montare le guide sotto le guide di copertura in vetro e il mezzo di montaggio e lasciare asciugare piatte.

Osservare al microscopio ottico. La percentuale di cellule colpite è stata calcolata utilizzando un microscopio ottico. I risultati hanno indicato che il trattamento con acido ossalico ha influenzato significativamente le cellule nel midgut.

L'immunocolorazione ha mostrato prodotti di reazione rossi o marroni positivi nei nuclei apoptotici delle ghiandole ipofaringee. Il prodotto di reazione positiva dopo trattamento con imidacloprid o cufafos è stato determinato nella maggior parte delle cellule ghiandolari. Quando si solleva la maschera della testa dell'ape, fare attenzione a non danneggiare o staccare le parti delle ghiandole ipofaringee.

Questa tecnica rileva i cambiamenti subclinici nelle api ed è adatta anche per la rilevazione di altri effetti ambientali sulle api e su alcuni altri organismi viventi.