Generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani da cellule staminali pluripotenti

Questo protocollo delinea la nostra generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani da cellule staminali pluripotenti. Questa tecnologia può essere utilizzata per studiare aspetti della vasculogenesi, dell'angiogenesi, delle malattie vascolari e delle patologie vascolari. La riproducibilità e la natura ad alto rendimento, così come la sua coerenza in molte diverse linee di cellule staminali, sono forti vantaggi di questa tecnica.

In termini di applicazione, alcune delle nostre precedenti ricerche delineano l'uso di organoidi dei vasi sanguigni per studiare i cambiamenti morfologici per la vascolarizzazione del paziente diabetico ed esplora le vie di trattamento farmacologico per la vasculopatia diabetica. Mantenere correttamente la popolazione iniziale di cellule staminali, prevenire l'aggregazione degli aggregati e garantire un diametro aggregato quasi omogeneo, questi sono fattori essenziali per generare buoni organoidi dei vasi sanguigni. Iniziare la generazione di aggregati utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in coltura, o hPSC, con una confluenza del 70%.

Utilizzando una pipetta o un sistema a vuoto, aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con un millilitro di reagente di dissociazione cellulare prima di incubare le cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, preparare il volume necessario di mezzo di aggregazione in un tubo conico da 15 millilitri, seguendo la formulazione menzionata nel manoscritto testuale. Dopo aver incubato le cellule, aspirare il reagente di dissociazione cellulare prima di sospendere le cellule in un millilitro di mezzo di aggregazione.

Pipettare delicatamente il contenuto su e giù per creare una sospensione a cella singola. Contare le cellule utilizzando un dispositivo automatico di conteggio delle cellule o al microscopio e calcolare il numero totale di cellule necessarie per la formazione degli aggregati. La lettura della vitalità cellulare mostra la sospensione a singola cellula con cluster bassi o nulli.

Aspirare il surnatante dal tubo e aggiungere il volume appropriato della sospensione cellulare al mezzo di aggregazione nel tubo conico in polipropilene ad alta trasparenza da 15 millilitri e pipettare delicatamente la sospensione cellulare diluita su e giù per garantire una distribuzione cellulare omogenea. Pipettare tre millilitri della sospensione cellulare diluita in ciascun pozzetto desiderato della piastra di coltura a sei pozzetti a bassissimo attacco. Posizionare la piastra nell'incubatore e ridurre al minimo qualsiasi disturbo per mantenere le dimensioni e la forma degli aggregati.

Preparare il mezzo del mesoderma come descritto nel manoscritto testuale. 24 ore dopo la semina delle cellule, estrarre la piastra di coltura dall'incubatore. Ruotare la piastra con un movimento circolare per accumulare gli aggregati al centro di ciascun pozzetto.

Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire delicatamente gli aggregati con il mezzo da ciascun pozzetto nel tubo conico corrispondente. Lasciare sedimentare gli aggregati nei tubi conici a temperatura ambiente per un'ora. Una volta sedimentato, aspirare il surnatante con una pipetta o una pompa di aspirazione ad alta sensibilità con cautela, senza disturbare gli aggregati sedimentati.

Risospendere gli aggregati in ogni tubo aggiungendo due millilitri di mezzo di induzione del mesoderma. Quindi, trasferire la sospensione da ciascun tubo nel rispettivo pozzetto della piastra di coltura a sei pozzetti di attacco ultra-bassa. Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e lasciarla fino al quarto giorno.

Il quarto giorno, estrarre la piastra di coltura dall'incubatore, quindi scuotere la piastra con un movimento circolare per raccogliere gli aggregati al centro di ciascun pozzetto. Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire delicatamente gli aggregati con il mezzo circostante da ciascun pozzetto nel tubo conico corrispondente. Impostare un timer per 30 minuti per consentire agli aggregati di sedimentare nei tubi.

Una volta che gli aggregati sedimentano, preparare le piastre di coltura come precedentemente dimostrato e posizionarle nell'incubatore a 37 gradi Celsius fino al sesto giorno. Per l'incorporazione di aggregati e l'induzione di germogli di vaso, preparare il volume finale desiderato della soluzione di matrice extracellulare mentre si lavora sul ghiaccio. Pipettare 500 microlitri di ECM in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti per formare il primo strato del sandwich ECM.

Per garantire un'efficace polimerizzazione del primo strato ECM, posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per due ore. Verso la fine dell'incubazione di due ore, inizia a lavorare con gli aggregati nella piastra di coltura. Raccogliere gli aggregati al centro di ciascun pozzetto prima di utilizzare una pipetta da un millilitro per trasferire delicatamente gli aggregati e il mezzo da ciascun pozzetto in un corrispondente tubo conico da 15 millilitri.

Lasciare decantare gli aggregati per 10-15 minuti prima di aspirare il surnatante. Dopodiché, tenere i tubi conici contenenti gli aggregati su ghiaccio per cinque minuti. Lavorando rapidamente e con attenzione, risospendere gli aggregati in 500 microlitri di ECM senza formazione di bolle.

Utilizzando una pipetta, sovrapporre la sospensione di aggregati ECM sopra il primo strato ECM già polimerizzato all'interno del pozzetto nella piastra a 12 pozzetti. Nel frattempo, prepara il mezzo di germinazione come descritto nel manoscritto testuale. Dopo due ore di incubazione a 37 gradi Celsius, aggiungere un millilitro di mezzo di germinazione preriscaldato a 37 gradi Celsius nel pozzo per indurre la differenziazione dei vasi sanguigni.

Lavorando in condizioni sterili, utilizzare l'estremità arrotondata di una spatola sterile per allentare la matrice di germinazione ECM contenente le reti vascolari. Quindi, usando una pinza sterile e l'estremità arrotondata di una spatola sterile, trasferire con attenzione il disco di gel allentato sul coperchio di un piatto di coltura di 10 centimetri. Posizionare il gel sul coperchio sotto uno stereomicroscopio regolato per l'ingrandimento e la messa a fuoco desiderati e utilizzare aghi sterili per tagliare le reti di singoli vasi sanguigni, cercando di limitare la quantità di ECM non vascolarizzata ottenuta nel processo.

Trasferire delicatamente gli organoidi isolati in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti di attacco ultra-bassa contenente tre millilitri di terreno di germinazione. Successivamente, utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire i singoli organoidi al numero appropriato di pozzetti in una piastra a 96 pozzetti ultra-bassa. Una volta trasferito, aggiungere 200 microlitri di mezzo di germinazione preriscaldato in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.

Da quattro a sei giorni dopo l'isolamento nella piastra da 96 pozzetti, assicurarsi che gli organoidi possiedano una morfologia rotonda e sana prima di procedere a fissarli e colorarli. Le immagini della progressione graduale della generazione di organoidi dei vasi sanguigni umani, o hBVO, da hPSC sono state catturate in campo luminoso. Il giorno zero, dalla coltura hPSC sono stati generati aggregati che vanno da 30 a 100 micron di diametro.

Sottili cambiamenti nelle dimensioni e nella forma degli aggregati sono stati osservati all'induzione del mesoderma il primo giorno, che è ulteriormente cambiato il quarto giorno quando gli aggregati sono stati sottoposti a priming vascolare. La germinazione precoce dei vasi quasi radialmente simmetrica può essere osservata il settimo giorno, un giorno dopo aver incorporato gli aggregati nella matrice di germinazione. La morfologia organoide sana e la continua germinazione dei vasi sono state osservate il nono giorno, che è progredito fino alla fase avanzata dei vasi che germogliano entro il giorno 10 quando le dense strutture cellulari al centro organoide sono quasi scomparse.

La morfologia tipica degli organoidi dei vasi sanguigni umani maturi è stata chiaramente osservata entro il giorno 15. La colorazione a montaggio intero degli hBVO maturi al giorno 15 ha mostrato una rete endoteliale estesa e connessa che era CD31-positiva e circondata da parassiti PDGFR-beta-positivi e actina della muscolatura alfa-liscia SMA-positiva. Le cellule murali PDGFR-beta-positive e SMA-positive che incapsulano le reti dei vasi endoteliali sono ben osservate.

È stata anche osservata una membrana basale continua di collagene IV-positivo che avvolge le reti vascolari. Garantire una corretta polimerizzazione della matrice extracellulare durante la fase di incorporazione è fondamentale per un'efficace germinazione dei vasi sanguigni. I ricercatori hanno utilizzato la nostra tecnologia degli organoidi dei vasi sanguigni per generare compartimenti vascolari precoci in modelli organoidi già stabiliti, come cervello e reni, che in precedenza erano aspercolari.