Name: Coltura a lungo termine di fette organotipiche del midollo spinale di topo come piattaforma per la convalida del trapianto di cellule nella lesione del midollo spinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Scopri la coltura a lungo termine di fette organotipiche del midollo spinale di topo per validare terapie cellulari. Questo metodo es vivo migliora sopravvivenza, integrazione e maturazione delle cellule staminali neurali trapiantate.

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Lo studio è stato sostenuto dalla Fondazione Wings for Life (WFL-IT- 20/21), dal Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) Next-Generation EU-Mission 4 component 2, dall'investimento n. 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8), e da Marina Romoli Onlus. Questo manoscritto riflette solo i punti di vista e le opinioni degli autori, né l'Unione Europea né la Commissione Europea possono essere considerati responsabili per essi. Dati e metadati sono disponibili su Zenodo 10.5281/zenodo.10433147. Le immagini sono state generate con il https://www.biorender.com/ Biorender.

Attecchimento a lungo termine di cellule h-SC-NES in colture organotipiche del midollo spinale

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Non esiste ancora un trattamento efficace per i pazienti con lesione midollare. Sono stati testati diversi approcci e uno dei più promettenti si basa su una strategia rigenerativa di sostituzione cellulare. Attualmente, i progressi nel campo della medicina rigenerativa richiedono nuove piattaforme per testare l'efficacia e la sicurezza dei trapianti cellulari, da soli o in combinazione con altri approcci. La loro convalida preclinica è essenziale per proseguire gli studi clinici. Le colture organotipiche SC sono una piattaforma utile per studiare diversi aspetti della neurodegenerazione, della rigenerazione neurale e del neurosviluppo e per studiare l'efficacia di nuovi approcci terapeutici23. In particolare, le caratteristiche specifiche delle colture organotipiche, come il mantenimento dell'istoarchitettura originale e della composizione cellulare e del microambiente, sono vantaggiose per svelare le dinamiche del trapianto, come l'attecchimento, l'integrazione, il differenziamento e la maturazione cellulare.
Coerentemente con i protocolli pubblicati, le fette organotipiche SC possono essere mantenute in coltura per circa 2-3 settimane in condizioni di salute, il che ne limita l'uso per le indagini a lungo termine e lo screening funzionale necessari per i programmi di test della terapia cellulare. L'esplorazione di processi importanti come la differenziazione e la maturazione verso il corretto destino delle cellule trapiantate all'interno del tessuto SC richiede un monitoraggio a lungo termine. Questi processi cellulari sono fondamentali durante i trapianti comuni in modelli animali. La disponibilità di un sistema ex vivo che imiti molte caratteristiche presenti in vivo sarebbe utile nella fase di screening preclinico.
Per questo motivo, in questo lavoro, proponiamo un metodo di coltura organotipica SC ottimale a lungo termine (≥30 giorni) che consente di mantenere fette di SC vitali fino a 90 giorni, triplicando il loro consueto periodo di coltura. Inoltre, mostriamo un attecchimento stabile delle cellule h-SC-NES all'interno delle fette SC e il mantenimento della coltura del trapianto fino a 30 giorni. Abbiamo monitorato l'attecchimento cellulare nel tempo osservando l'espressione di GFP per verificare la sopravvivenza cellulare fino a DPT 30. Dopo 30 DPT, abbiamo valutato il tasso di apoptosi cellulare. In letteratura, è stata riportata la valutazione dell'apoptosi delle cellule h-SC-NES trapiantate in sezioni SC a 7 DPT40. Qui, abbiamo esteso l'analisi dell'apoptosi cellulare a DPT 30 per confrontare il tasso di apoptosi rispetto al punto temporale precedente (DPT 7). Abbiamo scoperto che i nostri dati sono in linea con la letteratura, suggerendo che le cellule h-SC-NES trapiantate sopravvivono anche in un momento successivo se vengono mantenute nelle condizioni di coltura ottimizzate nel nostro lavoro. Questa piattaforma ex vivo a lungo termine migliorata, da sola e nella configurazione del trapianto, aiuterà i ricercatori nello screening preclinico per i trapianti di cellule staminali per la lesione midollare. Ciò consentirà loro di identificare la migliore cellula candidata per ulteriori studi in vivo che promuovono il successo dei trapianti. Inoltre, dopo lo screening iniziale, le fette organotipiche di SC potrebbero anche essere utilizzate in parallelo agli studi in vivo per confermare e corroborare le dinamiche e i comportamenti cellulari a lungo termine osservati in modelli animali o per supportare studi meccanicistici.
Il nostro protocollo descrive in dettaglio come generare questo modello organotipico a lungo termine, ma dovrebbero essere discussi anche alcuni passaggi critici. Per quanto riguarda la generazione delle colture organotipiche SC, ci sono alcune sfide durante l'intervento chirurgico e le prime fasi della coltura. Una procedura chirurgica ben eseguita è essenziale per generare fette che mantengano l'istoarchitettura originale. Se la SC si rovina durante l'isolamento, le fette possono perdere la loro tipica struttura anatomica e il danno tissutale può indurre un eccessivo insulto pro-infiammatorio che porta a condizioni malsane e morte cellulare. La fase più impegnativa durante l'intervento chirurgico è l'estrazione della SC dalla spina dorsale e la rimozione delle meningi dalla SC isolata. Il successo di questi passaggi dipende dall'esperienza dell'operatore; Pertanto, si consiglia un periodo di formazione prima di iniziare con gli esperimenti.
Anche la sezione coronale della SC attraverso un elicottero è una fase impegnativa. L'SC isolato deve essere posizionato sul piatto di taglio esattamente perpendicolarmente alla lama. L'operatore deve inoltre posizionare la lama perpendicolarmente al piatto di taglio. Queste precauzioni sono necessarie per garantire la generazione di fette riproducibili tra lo stesso e diversi esperimenti. Un altro problema importante è che il tempo per l'intervento chirurgico è limitato: l'intera procedura di generazione della fetta deve richiedere ~30 minuti. Se l'operatore dedica più tempo alla chirurgia e al taglio, il tessuto SC ne risentirà e questo può compromettere il successo della coltura e le fasi successive dell'esperimento.
Una volta che le fette sono state posizionate sulla membrana di coltura, è importante nutrirle correttamente. Il GDNF è necessario per sostenere il recupero e la sopravvivenza dei tessuti. Il taglio con un tritatutto è traumatico per il tessuto e, per questo motivo, le fette vengono posizionate subito dopo il taglio in un mezzo di dissezione ghiacciato per ripulire l'eccesso di molecole pro-infiammatorie e che promuovono la morte. Quindi, le fette vengono posizionate sulle membrane di coltura (inserti di coltura cellulare) con terreno fresco modificato con GDNF per favorire un recupero più rapido e l'adesione della fetta alla membrana. GDNF dovrebbe essere aggiunto al terreno ogni giorno per la prima settimana in coltura a causa della sua breve emivita50,51. Abbiamo osservato che le fette necessitano della presenza continua di GDNF durante i primi giorni di coltura per promuovere il recupero e la vitalità dei tessuti. In ogni caso, poiché la presenza di GDNF è importante per l'intero periodo di coltivazione, è fortemente sconsigliato interrompere la somministrazione di GDNF in momenti successivi.
Durante la prima settimana di coltura, è anche importante controllare le fette macroscopicamente a occhio e al microscopio. Il tessuto traslucido e la trasparenza dei bordi sono segni di una corretta adesione delle fette alla membrana e del tessuto vitale. Il tessuto necrotico apparirà estremamente bianco alla prima vista macroscopica e le aree necrotiche appariranno grigio scuro al microscopio. Dopo alcune settimane di coltura, la morfologia del tessuto può cambiare: i movimenti cellulari e l'adesione del tessuto alla membrana possono influenzare questo processo. Abbiamo osservato, ad esempio, la perdita del lume centrale in alcune fette piene di cellule e la perdita della morfologia del corno dorsale e ventrale. Questo accade principalmente con fette più piccole, mentre la maggior parte di esse manterrà una struttura anatomica vicina a quella originale. Le fette vengono solitamente generate dalla regione lombare o toracica perché in questo modo possono avere le dimensioni adeguate per mantenere nel tempo la loro istoarchitettura originaria: se sono troppo piccole, perdono la loro architettura mentre, se troppo grandi, la regione centrale può andare incontro a necrosi. Pertanto, abbiamo utilizzato la regione lombare dei cuccioli di topo per generare fette di dimensioni adeguate per una coltura ottimale a lungo termine ma, in linea di principio, possono essere considerati altri segmenti. Inoltre, abbiamo scelto di utilizzare la regione lombare, perché le regioni ventrale e dorsale sono più distinguibili l'una dall'altra. Inoltre, questa regione presenta aree tissutali con una percentuale più elevata di motoneuroni e materia grigia, che sono siti di interesse per le terapie di sostituzione cellulare nella lesione midollare. Per quanto riguarda il trapianto di cellule nelle fette, il problema principale è legato alla rottura della punta del microago di vetro. Se il foro per il passaggio delle cellule è troppo grande, può causare danni al tessuto SC durante la microiniezione. Se è troppo piccolo, l'impilamento delle cellule può ostruire l'ago, ostacolando il processo di trapianto. La procedura di trapianto deve essere completata entro 1 ora per ridurre al minimo la sofferenza e la morte delle cellule.
Il protocollo proposto fornisce uno strumento ottimale e versatile per diversi tipi di indagini. Qui, applichiamo la nostra piattaforma a lungo termine per convalidare il trapianto di cellule h-SC-NES nelle prime fasi di differenziazione all'interno del tessuto SC di topo per 30 giorni. La principale novità dell'approccio proposto è l'ottimizzazione del protocollo di co-coltura. I componenti della GM sostengono la sopravvivenza neuronale a lungo termine delle fette di SC e delle cellule h-SC-NES trapiantate. Infatti, gli OGM, essendo un terreno privo di siero, sostengono la differenziazione delle cellule trapiantate verso il destino neuronale rispetto al terreno precedentemente utilizzato per la coltura organotipica di fette47.
Per quanto riguarda i modelli proposti per la lesione midollare, gli esperimenti vengono solitamente eseguiti su topi adulti. Finora, le differenze più importanti tra SC neonatale e adulto sono legate al più alto potenziale rigenerativo riscontrato nel neonato rispetto ai topi adulti52. Tuttavia, tali differenze non hanno alcun impatto sul tipo di protocollo che stiamo proponendo, poiché qui ci concentriamo sulla risposta delle cellule trapiantate all'ambiente del tessuto ospite piuttosto che sulle capacità di rigenerazione dei neuroni residenti. Un'altra differenza tra topi neonatali e adulti dopo una lesione midollare è legata alla formazione della cicatrice gliale che si verifica negli adulti. Questo aspetto non viene preso in considerazione nel modello proposto, che non considera i complessi processi fisiopatologici conseguenti alle lesioni primarie e secondarie.
Per quanto riguarda le applicazioni, la piattaforma potrebbe essere utilizzata anche per studiare l'integrazione tra le cellule trapiantate con i circuiti residenti presenti nel modello organotipico SC. Gli strumenti di ingegneria genetica erano già utilizzati nel SNC per valutare la connettività sinaptica e potrebbero essere sfruttati a questo proposito 53,54,55. In particolare, l'integrazione potrebbe essere studiata e validata valutando la formazione di sinapsi tra le cellule trapiantate e il tessuto SC ex vivo. Queste colture organotipiche a lungo termine potrebbero anche essere sfruttate per testare agenti neuroprotettivi e neurorigenerativi o nuove molecole/materiali o per studiare malattie neurodegenerative che coinvolgono la SC. Per studiare specifiche malattie neurodegenerative, il protocollo deve essere adattato per la coltura di fette di SC generate da modelli rilevanti, come topi transgenici portatori di specifiche mutazioni associate alla patologia, allo stadio rilevante per la patologia (ad esempio, neonatale, giovanile, adulto). In conclusione, il nostro protocollo e le colture organotipiche in generale, essendo espianti di uno specifico organo, presentano caratteristiche che colmano il divario tra le colture cellulari 2D e i modelli in vivo, confermandosi uno strumento prezioso sia per la ricerca di base che per i test preclinici.

La lesione traumatica del midollo spinale (SCI) ha conseguenze fisiche, psicologiche ed economiche devastanti per i pazienti e gli operatori sanitari1. Molti tentativi sono stati fatti per promuovere la rigenerazione assonale nella lesione midollare con diversi approcci 2,3,4 e alcuni effetti benefici sono stati dimostrati dalla formazione di relè neuronali tra neuroni prossimali e distali nel sito di lesione attraverso terapie di sostituzione cellulare. L'interesse per le terapie cellulari è ancora in crescita5 poiché le cellule trapiantate possono svolgere molti ruoli, tra cui fornire supporto trofico, modulazione immunitaria, rigenerazione dei circuiti neurali persi attraverso l'induzione della plasticità, sostituzione cellulare e rimielinizzazione degli assoni6.
Recentemente, lo sforzo principale nel campo si è concentrato sulle cellule staminali/progenitrici neurali umane (NSC/NPCs)7. Diversi studi suggeriscono che le NSC/NPC modulano la risposta degli astrociti8, promuovono la secrezione di fattori prorigenerativi 9,10 e sostituiscono le cellule neuronali mancanti nella LMC11,12. Tuttavia, gli studi che supportano la differenziazione delle cellule trapiantate in neuroni funzionali sono ancora scarsi. Inoltre, la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule trapiantate nel midollo spinale danneggiato (SC) sono basse13, probabilmente perché le cellule trapiantate impiegano diverse settimane, anche mesi, per differenziarsi in vivo. Inoltre, gli studi attuali non hanno completamente chiarito molti aspetti biochimici, molecolari, cellulari e funzionali delle terapie di sostituzione cellulare. In questo contesto, sono necessari modelli semplici, veloci ed economici per studiare i meccanismi dell'attecchimento cellulare, la capacità delle cellule trapiantate di proliferare, differenziarsi in tipi specifici o sottopopolazioni di cellule e formare sinapsi con i neuroni residenti.
L'integrazione degli studi istologici nella registrazione elettrofisiologica e nella profilazione del trascrittoma e del proteoma è necessaria per una piena comprensione della cascata molecolare che si verifica dopo il trapianto di cellule. Questo sicuramente accelererà la progettazione e la convalida di nuove terapie di sostituzione cellulare in modelli preclinici e studi clinici. Infatti, fino ad oggi, l'uso di roditori, animali di grossa taglia e primati non umani è stato utile per chiarire molti processi cellulari dopo il trapianto14. Tuttavia, a causa dell'alto costo, dell'alto impatto etico, nonché della complessità dell'organismo, il loro utilizzo spesso non è semplice o non è adeguato a svelare i processi biochimici e molecolari. Inoltre, possono presentare molti svantaggi correlati a differenze biologiche, sia interspecie (metabolismo) che variabilità intraspecie (sesso, età).  Questi fattori, insieme a fattori esterni come situazioni di stress, potrebbero alterare l'esito di un esperimento e la loro prevedibilità in termini di traduzione terapeutica nell'uomo 15,16,17.
Pertanto, molti gruppi impiegano colture cellulari 2D in vitro e fette organotipiche ex vivo (colture ex vivo) oltre ai modelli animali. La coltura cellulare 2D è il sistema più comunemente utilizzato per lo studio di processi biologici specifici a livello di singola cellula e/o popolazione cellulare. Tuttavia, le colture cellulari monostrato non riflettono la complessità che si trova in un intero organismo. La mancanza di strutture tissutali e di ambiente fisiologico non consente ai sistemi di coltura 2D di emulare completamente gli aspetti strutturali, morfologici e funzionali chiave del tessuto studiato 18,19,20.Le colture organotipiche possono superare alcuni di questi problemi. I modelli organotipici si basano sull'espianto di un frammento di un tessuto o di un organo e sul suo mantenimento ex vivo per un periodo limitato21,22. In particolare, vengono generate fette di tessuto espiantato con uno spessore preciso che permette ai nutrienti di raggiungere facilmente quasi tutte le cellule delle fette. Possono essere generati da varie regioni del sistema nervoso centrale, come l'ippocampo, l'ipotalamo, il cervelletto, il talamo, la corteccia cerebrale, la substantia nigra e lo striato e il midollo spinale23. Le colture organotipiche conservano l'architettura tissutale, la distribuzione spaziale delle cellule, la diversità cellulare e l'ambiente (cioè la composizione della matrice extracellulare) dell'organo di origine. Inoltre, conservano l'attività neurale originale, le connessioni tra le cellule e, in particolare, i circuiti a breve distanza dopo l'espianto.
Questi aspetti forniscono alcuni vantaggi per le colture ex vivo rispetto sia alle colture monostrato che ai modelli animali. Mantengono le caratteristiche tissutali chiave riscontrate in vivo ma con la riduzione dei costi e la possibilità di eseguire diversi tipi di esperimenti molecolari, cellulari e funzionali con un'accurata regolazione dei parametri ambientali della coltura 24,25,26,27,28,29. Le fette organotipiche possono anche essere sfruttate per sviluppare modelli per diversi disturbi neurologici assomigliando alle caratteristiche istopatologiche chiave di condizioni specifiche30. Inoltre, la conservazione dell'ambiente tissutale multicellulare originale li rende piattaforme appropriate per lo screening di farmaci e per testare molecole e materiali neuroprotettivi e neuro-rigenerativi.
In questo lavoro, proponiamo l'uso di colture organotipiche di SC come modello per ottimizzare i trapianti di NSC. Questo non è banale poiché sono necessarie condizioni di coltura ottimali per garantire la sopravvivenza sia dell'ospite (tessuto SC) che del trapianto (NSC) per settimane. Diversi gruppi di ricerca hanno innestato in colture organotipiche, derivate dal cervello e derivate da SC, vari tipi di cellule. La maggior parte dei lavori ha mostrato il trapianto di cellule staminali mesenchimali31,32,33, cellule di rivestimento olfattivo34 o NSC 35,36,37,38,39,40 e ha valutato le interazioni delle cellule trapiantate con le cellule ospiti, la sopravvivenza dell'intero sistema e se le cellule trapiantate si differenziano in neuroni o cellule simili ai neuroni all'interno dell'ambiente tissutale ex vivo 32,33,41. Alcuni di loro hanno valutato il potenziale rigenerativo delle cellule dopo il trapianto, osservando la loro crescita assonale all'interno del tessuto 37,40,41, la capacità mielinizzante dei precursori trapiantati di oligodendrociti 42, la migrazione delle cellule trapiantate nel tessuto ospite43 e se le cellule trapiantate rilasciavano fattori che spingevano verso un ambiente pro-rigenerativo31. Una limitazione degli studi attuali è che non esplorano l'attecchimento per un periodo a lungo termine.
Considerando che le NSC sembrano richiedere diverse settimane per differenziarsi in vivo44,45, questo studio si concentra su come generare e mantenere fette di SC di topo a lungo termine (≥30 giorni) per un massimo di 90 giorni. Si è scoperto che le fette conservano la loro struttura anatomica originale e mantengono un tasso di apoptosi basso e stabile nel tempo e un'elevata vitalità cellulare. Abbiamo osservato l'espressione diffusa dei marcatori neuronali RNA binding fox-1 homolog 3 (RBFOX3) e neurofilament light chain (NFL), con quest'ultimo che mostra una tendenza crescente di germinazione assonale attorno alle fette nel tempo, attestando la loro condizione di salute. Inoltre, abbiamo trapiantato con successo nelle SC-slice cellule staminali neuroepiteliali umane derivate da FGP (H-SC-NES) nelle prime fasi del differenziamento neuronale. L'innesto di NSC è stato mantenuto per 30 giorni dopo il trapianto e le cellule hanno mostrato espressione di GFP per tutto il periodo in coltura. Anche il tasso di apoptosi delle cellule al giorno post-trapianto (DPT) 30 è risultato essere in linea con il valore del tasso di apoptosi osservato a DPT 7 nelle stesse cellule40. Le cellule sembravano innestarsi nell'ambiente tissutale e sopravvivevano fino a diverse settimane.
In sintesi, i nostri dati dimostrano che è possibile mantenere in coltura fette organotipiche di SC per 3 mesi senza compromettere la loro citoarchitettura originale e l'ambiente tissutale. Soprattutto, possono essere sfruttati per testare terapie cellulari prima di procedere con un esperimento in vivo , riducendo così i costi e i tempi sperimentali. Qui, illustriamo in dettaglio tutti i passaggi per generare fette organotipiche di SC di topo e come mantenerle per periodi di lungo periodo (≥30 giorni). Inoltre, spieghiamo in modo approfondito come eseguire il trapianto di NPC nelle fette e come mantenerle per l'analisi a valle.

<table><tbody><tr><td>Caspasi anti-scissione-3,&nbsp; (asp175) (5A1E) (Coniglio)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9661S</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-GFP (Topo) - monoclonale</td><td>Sigma/Merck</td><td>G6539</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-Nuclei umani (Topo) - monoclonale, clone 235-1&nbsp;</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1281</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-Nuclei Umani (Coniglio)</td><td>NeoBiotechnologies</td><td>RBM5-346-P1</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NeuN (RBFOX3) (Coniglio) - policlonale</td><td>Sigma/Merck</td><td>ABN78</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL (Topo)</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1615</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL H-Phospho (Coniglio) - biologend policlonale</td><td></td><td>840801</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Aqua Polymount</td><td>Poly-sciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Gibco</td><td>PHC7074</td><td></td></tr><tr><td>Lame</td><td>Leica</td><td>118364227</td><td></td></tr><tr><td>Acqua graduata per colture cellulari</td><td>Sigma/Merck</td><td>W3500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Collagene da coda di ratto</td><td>Sigma/Merck</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale - Microscopio confocale A1 (Eclipse Ti)</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucosio</td><td>Sigma/Merck</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Pinze da dissezione</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma/Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma/Merck</td><td>gf144</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Sigma/Merck</td><td>SRP3200</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro, 3,5"&nbsp;</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Capra-anti Topo IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Capra-anti Topo IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21236</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Capra-anti Coniglio IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td>1:500</td></tr><tr><td>capra-anti coniglio igg alexa fluor 647</td><td>thermo fisher</td><td>scientific a21244</td><td>1:500</td></tr><tr><td>grafico pad-prisma</td><td>dotmatics</td><td>software per analisi</td><td></td> statistiche</tr><tr><td>hbss</td><td>gibco</td><td>14025-050</td><td>1:500</td></tr><tr><td>hepes</td><td>gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>hoechst 33342</td><td>thermo fisher scientific</td><td>h3570</td><td></td></tr><tr><td>cavallo Siero</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma/Merck</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma/Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Preparazione lentivirale</td><td>Addgene</td><td>17446-LV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio della vitalità/citotossicità LIVE/DEAD</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L32250</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Punte per microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>per caricare le cellule nell'ago per il trapianto</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>VWR</td><td>631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Membrana per colture cellulari Millicell</td><td>Sigma/Merck</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali copri miscroscopio</td><td>VWR&nbsp;</td><td>ECN 631-1572</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>neurobasale</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri (35mm)</td><td>VWR</td><td>734-2317</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma/Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta pasteur in plastica</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatico PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>Microiniettore per trapianto</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma/Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi No 10 Sterile in acciaio inossidabile</td><td>VWR International</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Spring Forbici</td><td>World Precision Instruments</td><td>501235</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio per imaging e acquisizione</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio per chirurgia</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette-Dumont #5-inox</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Vannas, 8,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore verticale per micropipette</td><td>Strumento</td><td>otturatore P-30</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>R& Sistemi D</td><td>1254/50</td><td></td></tr></tbody></table>

coltura a lungo termine di fette organotipiche del midollo spinale di topo come piattaforma per la convalida del trapianto di cellule nella lesione del midollo spinale

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

Mancano ancora cure risolutive per le lesioni del midollo spinale (SCI), a causa della complessa fisiopatologia. Uno degli approcci rigenerativi più promettenti si basa sul trapianto di cellule staminali per sostituire il tessuto perso e promuovere il recupero funzionale. Questo approccio dovrebbe essere ulteriormente esplorato meglio in vitro ed ex vivo per verificarne la sicurezza e l'efficacia prima di procedere con sperimentazioni sugli animali più costose e dispendiose in termini di tempo. In questo lavoro, mostriamo la creazione di una piattaforma a lungo termine basata su fette organotipiche del midollo spinale (SC) di topo trapiantate con cellule staminali neurali umane per testare terapie di sostituzione cellulare per le SCI.
Le colture organotipiche SC standard vengono mantenute per circa 2 o 3 settimane in vitro. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato per la manutenzione a lungo termine (≥30 giorni) fino a 90 giorni. Il terreno utilizzato per la coltura a lungo termine di fette di SC è stato ottimizzato anche per il trapianto di cellule staminali neurali nel modello organotipico. Le cellule staminali neuroepiteliali umane derivate da SC (H-SC-NES) portatrici di un reporter di proteina fluorescente verde (GFP) sono state trapiantate in fette di SC di topo. Trenta giorni dopo il trapianto, le cellule mostrano ancora l'espressione di GFP e un basso tasso di apoptosi, suggerendo che l'ambiente ottimizzato ha sostenuto la loro sopravvivenza e integrazione all'interno del tessuto. Questo protocollo rappresenta un solido riferimento per testare in modo efficiente le terapie di sostituzione cellulare nel tessuto SC. Questa piattaforma consentirà ai ricercatori di eseguire un pre-screening ex vivo di diverse terapie di trapianto cellulare, aiutandoli a scegliere la strategia più appropriata prima di procedere con gli esperimenti in vivo .

I metodi descritti consentono la costituzione di fette organotipiche SC da topi allo stadio P3 e il loro mantenimento in coltura per un tempo prolungato in condizioni di salute. Inoltre, mostriamo un protocollo per il trapianto di cellule nelle fette e per la loro co-coltura per un massimo di 30 giorni (Figura 1). In primo luogo, mostriamo l'ottimizzazione delle condizioni di coltura e un protocollo adatto alla coltura prolungata delle fette di SC con cellule trapiantate (Figura 2A). Le fette vengono generate e mantenute da DEV 0 fino a DEV 2 nell'OM, che è stato originariamente proposto come mezzo ottimale per la manutenzione delle sezioni SC47. Tuttavia, a causa della presenza di proteine sieriche, questo mezzo potrebbe essere subottimale per sostenere la differenziazione neuronale e la maturazione delle cellule precursori neurali trapiantate. Infatti, al DEV 3, abbiamo testato il passaggio dall'OM al GM, una formulazione contenente Neurobasal plus B27, che supporta la sopravvivenza neurale, e senza siero, che inibisce il corretto differenziamento neuronale, promuovendo invece un destino gliale48,49.
La Figura 2B mostra i risultati ottenuti commutando il mezzo a DEV 3 da OM a GM, rispetto alle fette SC che non hanno ricevuto l'interruttore (le fette di controllo sono state coltivate in OM). Abbiamo utilizzato la distribuzione del segnale NFL all'interno delle fette come marcatore per l'integrità neuronale (Figura 2B, C). Le fette a DEV 7 erano sane in entrambe le condizioni di coltura, mostrando la distribuzione diffusa del neurofilamento (NFL, in verde) al loro interno. Al DEV 10, le fette coltivate in GM sembravano essere più sane rispetto alle fette di controllo coltivate in OM, come documentato dalla distribuzione delle colorazioni NFL. Abbiamo anche stimato l'area NFL+ (% Area NFL+ /Area DAPI+ ) delle fette mostrate nelle immagini rappresentative della Figura 2B. L'area NFL+ stimata è rappresentata negli istogrammi della Figura 2C, confermando che il segnale NFL è distribuito diffusamente nelle fette a DEV 7 in entrambe le condizioni. Tuttavia, a DEV 10, l'area stimata coperta dalla colorazione NFL diminuisce per la condizione di coltura OM.
Questi dati suggeriscono che il passaggio al GM a DEV 3 è ben tollerato per la coltura prolungata di fette di SC (DEV 10). Come passo successivo, abbiamo testato GM in momenti più prolungati: DEV 30, DEV 60 e DEV 90. Come mostrato nella Figura 3A, B, le fette sono state mantenute sane in coltura fino a DEV 90. La colorazione NFL è stata trovata ampiamente presente nelle fette in ogni momento, con una germinazione diffusa attorno alle fette di neuriti che partono dalla regione centrale. Infatti, abbiamo stimato l'area NFL+ delle fette mostrate nella Figura 3A ed è aumentata nel tempo, come mostrato negli istogrammi della Figura 3B. Abbiamo anche osservato positività al marcatore neuronale RBFOX3, fornendo un'altra linea di evidenza del differenziamento neuronale delle fette. Ad ogni punto temporale, abbiamo anche controllato il tasso di apoptosi valutando in diverse fette il numero di cellule positive ad aCASP3 (Figura 4A, B). L'analisi è stata eseguita come descritto nella sezione 10.2 del protocollo. Il tasso di apoptosi (% di cellule aCASP3+ /numero totale di cellule DAPI+ ) è risultato molto basso in ogni punto temporale (0,85 ± 0,52%, 0,71 ± 0,27%, 0,66 ± 0,45% per DEV 30, 60 e 90, rispettivamente) senza differenze significative tra i tre punti temporali considerati (valore p &gt; 0,05, Figura 4B). Questi dati suggeriscono che il tasso di apoptosia associato ad aCASP3 rimane stabile nel tempo e, insieme all'ampia distribuzione di NFL nelle fette (Figura 4A), confermano la sopravvivenza delle fette in ogni punto temporale.
A supporto dei dati precedenti, abbiamo anche eseguito un saggio vivo/morto per valutare la vitalità delle fette nei tre diversi punti temporali. Abbiamo usato la Calceina (colorazione verde) per marcare le cellule vitali e metabolicamente attive e Sytox (colorazione ciano) per valutare la morte cellulare. Come mostrato negli istogrammi della Figura 4C, la percentuale di cellule metabolicamente attive aumenta leggermente da DEV 30 a DEV 90 (93,17 ± 5,21%, 96,43 ± 3,02%, 96,33 ± 3,10% rispettivamente per DEV 30, 60 e 90), stabilizzandosi tra gli ultimi due punti temporali (DEV 30 vs DEV 60 p-value = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 p-value = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 p-value = 0,99). Abbiamo riscontrato bassi livelli di morte cellulare che sono diminuiti nel tempo (6,83 ± 5,21%, 3,57 ± 3,02%, 3,66 ± 3,10% per DEV 30, 60 e 90, rispettivamente) e una differenza significativa è stata riscontrata tra DEV 30 e i punti temporali successivi, DEV 60 e DEV 90 (DEV 30 vs DEV 60 p-value = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 p-value = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 p-value = 0,99). Questi dati, in associazione con il tasso di apoptosi, confermano la sopravvivenza della fetta nel tempo e supportano l'efficacia del protocollo di coltura a lungo termine eseguito.
Una volta stabilita la fattibilità della coltura prolungata delle fette di SC, abbiamo sfidato il sistema mediante trapianto di cellule h-SC-NES nelle prime fasi del differenziamento neuronale. Abbiamo testato le cellule h-SC-NES perché hanno mostrato risultati promettenti per il trattamento della lesione midollare12. La procedura di trapianto di cellule h-SC-NES nelle fette di SC di topo è descritta nella sezione 6 del protocollo. Le fette SC e le cellule h-SC-NES trapiantate sono state mantenute fino al DPT 30. Le cellule sono state innestate al DIV 10 di differenziazione (stadio di precursore neurale) in fette organotipiche DEV 4, come mostrato nello schema del protocollo della Figura 5A. Le cellule trapiantate sono state monitorate per l'espressione di GFP in coltura per un massimo di 30 giorni. La Figura 5B mostra immagini dal vivo rappresentative, a diversi DPT, di una fetta SC con cellule GFP+ trapiantate. L'espressione stabile della GFP nel tempo (Figura 5B e Figura 6A) suggerisce che le cellule sono sopravvissute nel tessuto SC nelle condizioni di coltura precedentemente ottimizzate. Abbiamo anche controllato il tasso di apoptosi delle cellule trapiantate come descritto nella sezione 10.2 del protocollo. Il tasso di apoptosi (% di cellule aCASP3+ /numero totale di cellule Hu-Nu+ ) è risultato molto basso (0,44 ± 0,34%) dopo 30 DPT (Figura 6B). Inoltre, il tasso di apoptosi a DPT 30 è risultato essere in linea con quello trovato per lo stesso tipo di cellule a DPT 7, come precedentemente riportatoa 40, documentando che le colture si stabilizzano nel tempo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro del protocollo. Schema rappresentativo che mostra il flusso di lavoro generale del protocollo eseguito. (A) A sinistra, uno schema che riassume la generazione di fette di SC di topo da SC isolate di cuccioli di topo a P3 e la coltura a lungo termine di fette organotipiche di SC. (B) A destra, uno schema che riassume il trapianto di cellule h-SC-NES che esprimono GFP in fette di topo SC-organotipiche. Le cellule innestate vengono mantenute per 30 giorni dopo il trapianto. Abbreviazioni: h-SC-NES = staminali neuroepiteliali derivati dal midollo spinale umano; GFP = proteina fluorescente verde; DEV = giorno ex vivo; DPT = giorno post-trapianto; NFL = catena leggera a neurofilamenti; RBFOX3= omologo 3 di fox-1 legante l'RNA; aCASP3 = Caspasi-3 attiva; SC= midollo spinale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> Figura 2: Ottimizzazione delle condizioni di coltura a lungo termine. (A) Schema rappresentativo del protocollo per testare OM e GM. L'OM viene mantenuto fino a DEV 7-10 per il gruppo di controllo. Il mezzo viene commutato al GM a DEV 3 per le fette trattate; quindi, vengono fissati a DEV 7-10 per il confronto con i controlli. (B) Immagini rappresentative che confrontano fette organotipiche di SC di topo a DEV 7 e 10 coltivate in diverse condizioni. Le fette sono colorate per il neurofilamento marcatore del citoscheletro (NFL, verde). L'ampia distribuzione della colorazione NFL in fette coltivate con GM suggerisce una sopravvivenza globale e una differenziazione. I nuclei sono controcolorati con DAPI. Barra della scala = 500 μm. (C) Istogrammi rappresentativi della stima dell'area coperta da NFL nelle fette mostrate in Figura 1B. Al DEV 10, la superficie della NFL diminuisce nella condizione di coltura OM. Abbreviazioni: DEV = giorno ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo; NFL = catena leggera a neurofilamenti.; OM = mezzo organotipico; GM = mezzo di innesto; SC = midollo spinale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> Figura 3: Fette organotipiche SC di topo coltivate a lungo termine. (A) Le fette vengono mantenute in coltura fino a DEV 90. Il test di immunofluorescenza rivela un'ampia distribuzione del neurofilamento marcatore citoscheletrico (NFL, verde) e del marcatore neuronale nucleare RBFOX3 (rosso), attestando la loro condizione di salute e identità neuronale dopo una coltura a lungo termine. Da notare, gli assoni NFL+ spuntano diffusamente attorno alle fette nel tempo. I nuclei sono controcolorati con DAPI. Barra della scala = 500 μm. (B) Istogrammi rappresentativi della stima dell'area e del tempo NFL+ e dell'area RBFOX3+ delle fette mostrate nel pannello A. L'area dei neuriti NFL+ aumenta nel tempo. Abbreviazioni: DEV = giorno ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo; NFL = catena leggera a neurofilamenti; SC = midollo spinale; RBFOX3= Omologo 3 di fox-1 legante l'RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> Figura 4: Valutazione della vitalità cellulare nelle fette SC nel tempo. (A) Immagini rappresentative di fette organotipiche a DEV 60 colorate per aCASP3 (rosso) e NFL (verde). Barra della scala = 100 μm. NFL mostra un modello diffuso. Cellule rare sono positive per il marcatore apoptotico aCASP3 (Inserti: 1-2-3). (B) Analisi del tasso di apoptosi in fette in diversi punti temporali. Media ± SD, N (si replica) = 6 fette, n (celle totali) &gt; 1.000 per ogni fetta, test di Kruskal-Wallis, confronto multiplo, p-value &gt; 0,05. Il tasso di apoptosi è stabile nel tempo. Nei riquadri 1-2-3 del pannello A, è possibile osservare i dettagli delle cellule positive per aCASP3 (colorazione rossa, frecce bianche). Piccoli punti rossi etichettano i detriti cellulari e i nuclei picnotici. Barra di scala = 50 μm. (C) Immagini rappresentative del saggio vivo/morto eseguito su fette SC a DEV 90: le cellule metabolicamente attive sono etichettate in verde con Calceina, mentre le cellule morte e danneggiate sono etichettate in azzurro chiaro (ciano) con Sytox. I due istogrammi mostrano la % di celle positive per Calceina (a sinistra) e Sytox (a destra) sul numero totale di celle. Per entrambe le ± medie SD, N (si replica) = 6 fette, n (celle totali) &gt; 1.000 per ogni fetta, test di Kruskal-Wallis, confronto multiplo, DEV 30 vs DEV 60 p-value = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 p-value = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 p-value &gt; 0,99. Abbreviazioni: DEV = giorno ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo; NFL = catena leggera a neurofilamenti; SC = midollo spinale; aCASP3 = caspasi-3 attiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> Figura 5: Trapianto di cellule h-SC-NES in fette organotipiche di topo. (A) Schema rappresentativo del protocollo di trapianto. Le cellule vengono trapiantate come precursori neurali al DIV 10 di differenziazione in fette organotipiche DEV 4. (B) Immagini rappresentative di fette organotipiche di topo trapiantate con cellule h-SC-NES che esprimono GFP nel tempo fino a DPT 30. Le cellule vengono trasdotte con un vettore lentivirale che trasporta il gene GFP . L'espressione di GFP nel tempo conferma la loro vitalità e adattamento all'ambiente della fetta. Barra della scala = 500 μm. Abbreviazioni: DIV = primo giorno in pre-differenziazione; h-SC-NES = staminali neuroepiteliali derivati dal midollo spinale umano; GFP = proteina fluorescente verde; DEV = giorno ex vivo; OM = mezzo organotipico; GM = mezzo di innesto; DPT = giorni dopo il trapianto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> Figura 6: Valutazione del tasso di apoptosi delle cellule h-SC-NES trapiantate dopo 30 giorni dal trapianto. (A) Immagine rappresentativa di una fetta organotipica di topo trapiantata con cellule h-SC-NES che esprimono GFP. Le cellule vengono trasdotte con un vettore lentivirale che trasporta il gene GFP per monitorarle nelle fette dopo il trapianto. L'espressione di GFP nel tempo conferma la loro vitalità e adattamento all'ambiente della fetta. Il punto temporale visualizzato è DPT 30; le cellule vengono colorate per i nuclei umani (ciano) e aCASP3 (rosso). Barra della scala = 150 μm. (B) A sinistra, grafico a torta rappresentativo dell'analisi dell'apoptosi di cellule trapiantate in fette a DPT 30 (N (si replica) = 5 fette, n (cellule) = 5.000) e a destra, un inserto di cellule Hu-Nu+ e un dettaglio di una cellula positiva ad aCASP3 (freccia bianca). Barra di scala = 75 μm. Piccoli punti rossi etichettano i detriti cellulari e i nuclei picnotici. Abbreviazioni: h-SC-NES = staminali neuroepiteliali derivati dal midollo spinale umano; GFP = proteina fluorescente verde; DPT = giorno post-trapianto; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo; NFL = catena leggera a neurofilamenti; aCASP3 = caspasi-3 attiva; Hu-Nu = nuclei umani. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Composizione delle soluzioni utilizzate in questo protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

In questo articolo, forniamo un metodo riproducibile per generare e mantenere a lungo termine fette organotipiche del midollo spinale trapiantate con cellule staminali neurali come modello ex vivo per testare terapie di sostituzione cellulare.

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