Infezione in vivo e in vitro delle radici della patata con nematodi parassiti delle piante per la valutazione dei cambiamenti strutturali indotti

Il protocollo descrive l'infezione delle radici di Solanum tuberosum con nematodi parassiti delle piante in condizioni di serra in vivo e radici transgeniche in vitro di patate per l'analisi istochimica della struttura radicale attraverso la microscopia ottica.

La ricerca sulle infezioni da nematodi parassiti nelle colture è influenzata dalla variabilità delle condizioni ambientali, che può influire in modo significativo sui risultati sperimentali e sulla riproducibilità dei dati.

Abbiamo sviluppato colture in vitro di radici transgeniche di patata con nematodi parassiti delle piante come alternativa affidabile che occupa meno spazio, richiede meno tempo per essere ottenuta ed è esente da contaminazioni o variabilità genetiche dell'ospite.

Tracciare la progressione temporale dell'infezione da nematodi nelle radici delle colture rimane una sfida. Le tecniche di colorazione differenziale forniscono un metodo affidabile per identificare i siti di infezione e distinguere con precisione le fasi di vita dei nematodi.

Rispetto alle prove in serra, le radici pesanti della patata supportano un sistema continuo e di controllo per fornire tutte le fasi di sviluppo dei nematodi, indipendentemente dalle variazioni stagionali o climatiche.

Quindi il protocollo descritto offre diverse promettenti applicazioni future. Ad esempio, consente studi dettagliati sui meccanismi molecolari e cellulari per fornire informazioni su come i nematodi parassiti delle piante infettano e manipolano gli ospiti.

[Narratore] Per iniziare, lava una carota sotto l'acqua corrente del rubinetto e poi con una comune soluzione detergente per rimuovere i detriti. Una volta asciugato con carta assorbente, inserisci uno spiedino di metallo sterilizzato nella parte superiore della carota, a circa uno o due centimetri verso l'interno. Con un flacone di lavaggio dotato di ugello, bagnare la carota con etanolo al 96%. Tamponare la punta inferiore della carota su una carta da filtro sterilizzata. Quindi passarlo con cura attraverso una fiamma. Con un pelapatate sterile, sbucciare la carota dall'alto verso il basso e ripetere la fiammatura. Dopo aver scartato le sezioni superiore e inferiore, posizionare la sezione centrale in una capsula di Petri sterile. Usando una lama sterile e una pinzetta, taglia sezioni spesse un centimetro. Trasferire le sezioni in piastre di Petri sterili. Dopo aver sigillato la piastra, tenerla sotto la luce UV per 60 minuti su ciascun lato per sterilizzare i dischi di carote. Incubare i dischi di carota a 25 gradi Celsius al buio per una o due settimane. Successivamente, con una lama sterile, praticare un'incisione a forma di X al centro del disco di carota, tagliando solo a metà profondità. Pipettare nell'incisione 50 microlitri di sospensione di nematode della lesione radicolare contenente almeno 50 fasi di vita mista. Dopo aver sigillato la capsula di Petri, incubarla a 25 gradi Celsius al buio per un massimo di tre mesi. Per estrarre i nematodi della lesione radicale, trasferire i dischi di carota con necrosi visibile in un setaccio a maglie da 75 micrometri con otto centimetri di diametro posto in una ciotola di vetro sterile. Quindi, versare la soluzione antibiotica sul setaccio fino a coprire i dischi. Dopo l'incubazione notturna al buio, utilizzare una pipetta sterilizzata per trasferire i nematodi dal fondo della ciotola a un blocco di colorazione in vetro sterilizzato. Pipettare un millilitro di soluzione antibiotica nel blocco colorante e lasciare che i nematodi si depositino per 30-40 minuti. Pipettare la soluzione antibiotica usata e ripetere il processo di lavaggio quattro o cinque volte. Utilizzare immediatamente la sospensione di nematode della lesione radicolare o conservare a 11 gradi Celsius. Seleziona i tuberi di patata della stessa dimensione e scarta quelli con buchi, lividi o sezioni morbide. Riempi vasi da cinque litri con una miscela uno a uno di terriccio per autoclave e sabbia e mescola 22,5 grammi di fertilizzante NPK a lenta cessione. Quindi seminare le patate a una profondità di nove centimetri sotto la superficie del suolo. Metti i vasi in una serra con un'umidità compresa tra il 50 e il 70%. Innaffia frequentemente per mantenere l'umidità del suolo al 70% della massima capacità di ritenzione idrica, evitando temperature estreme. Una volta che le piante di patate sono emerse, crea da quattro a sei fori distribuiti uniformemente attorno a ciascuna pianta per vedere la profondità. Pipettare nei fori otto millilitri di sospensione contenente 30.000 nematodi viventi con lesioni radicolari in fase di vita mista. Quindi, copri i buchi con una miscela di terreno. Per i vasi di controllo e i vasi contenenti nematodi delle lesioni radicali, sospendere l'irrigazione il giorno dell'inoculazione. Dopo due mesi di coltura, sradicare le piante di patate e separare i germogli e le radici per la pesatura. Lavare accuratamente l'apparato radicale. Esaminare le radici dei siti di attacco RLN utilizzando tecniche di colorazione appropriate. Metti i tuberi di patata lavati e sterilizzati in un contenitore. Copri i tuberi con una soluzione di candeggina commerciale al 25%. Chiudere il contenitore e mescolare per 15 minuti. Una volta smaltita la candeggina, sciacquare i tuberi tre volte con acqua di rubinetto sterilizzata. Successivamente, in una cappa di flusso, immergere i tuberi in una soluzione di etanolo all'80% per 15 minuti agitando vigorosamente. Dopo aver pipettato l'etanolo, sciacquare tre volte con acqua di rubinetto sterilizzata. Con un bisturi sterile, rimuovere le porzioni periferiche dei tuberi. Sezionare il pezzo centrale interno in segmenti spessi 0,5 centimetri. Per inoculare le sezioni, mescolare prima un millilitro di sospensione di Rhizobium rhizogenes con nove millilitri di terreno SH. Immergere la punta di un bisturi sterile nella sospensione diluita e avvolgere la superficie degli spicchi di patata cinque volte. Una volta asciugati i segmenti, posizionarli su un terreno SH semisolido e incubare a 25 gradi Celsius per tre giorni al buio per facilitare la trasfezione plasmidica. Alla fine del terzo giorno, trasferire i segmenti infetti in piastre contenenti terreno SH semisolido integrato con antibiotici. Dopo tre mesi, usa una pinzetta sterile per raccogliere un grappolo di un grammo di radici transgeniche. Trasferire le radici al centro del piatto con un terreno SH fresco semisolido privo di antibiotici. Per raccogliere le masse di uova di nematodi, ottenere le galle radicali. Usa un paio di pinzette sterili a punta ultra fine per estrarre con cura le masse di uova sotto uno stereomicroscopio binoculare impostato su un ingrandimento di 20x. Metti le masse di uova in una capsula di Petri coperta contenente cinque millilitri di acqua di rubinetto sterile e lasciale schiudere per 48 ore. Successivamente, in una cappa di flusso, pipettare cinque millilitri della sospensione J2 contenente 100 nematodi per millilitro su un setaccio a maglie da 20 micrometri. Dopo il lavaggio con acqua di rubinetto sterile, immergere la metà inferiore del setaccio contenente i nematodi J2 in una soluzione di perossido di idrogeno al 20% e mescolare con movimenti circolari per 15 minuti. Erogare acqua di rubinetto sterile attraverso il setaccio sopra i nematodi e ripetere il processo di lavaggio due volte. Inclinare il setaccio in modo che i nematodi si raccolgano sul bordo durante il lavaggio finale. Quindi, pipettare un millilitro di acqua ultrapura sterile dal bordo del setaccio per recuperare i nematodi. In una cappa a flusso, sottocoltura un ciuffo di un grammo di radici transgeniche di patate su piastre SH con 100 nematodi sterili. Monitorare regolarmente la co-coltura al microscopio invertito con un ingrandimento di 100x. Quando le masse di uova diventano visibili, sottocoltura le radici di una nuova piastra media SH. L'uso di dischi di carota ha portato a un aumento medio di 100 volte delle popolazioni di nematodi entro tre mesi. Le piante di patate non hanno mostrato sintomi visibili con un basso numero di popolazioni di nematodi con lesioni radicali. Diversi stadi di vita di Pratylenchus penetrans sono stati osservati nella corteccia radicolare dopo la colorazione con fucsina acida, indicando che la penetrazione del tessuto e le lesioni necrotiche associate erano chiaramente visibili nelle aree infette. Lo sviluppo delle radici transgeniche della patata ha mostrato una crescita iniziale della massa cellulare lungo le ferite indotte dal bisturi nella sezione del tubero della patata, seguita dall'emergere di radici transgeniche. Nel terreno di coltura è stata osservata una crescita sostenuta delle radici e i ciuffi di radici sono stati trasferiti con successo in un terreno di coltura fresco per una crescita continua. Le colture di radici transgeniche di patate sono state infettate con successo con giovani di secondo stadio di Meloidogyne chitwoodi per stabilire co-colture di nematodi vegetali. Nelle colture infette sono state osservate galle radicali contenenti femmine adulte e masse di uova. I tessuti biliari formati da Meloidogyne chitwoodi erano visibili dopo l'infezione delle radici transgeniche della patata con stadi distinti di sviluppo e riproduzione dei nematodi identificabili, inclusa la formazione di masse di uova e uova.