In vivo Imaging del calcio delle risposte neurali indotte dal gusto nella Drosophila adulta

Il nostro laboratorio utilizza il moscerino della frutta come organismo modello per studiare come le informazioni sul gusto vengono elaborate attraverso circuiti neurali, dal rilevamento di sostanze chimiche all'impatto sul comportamento. Stiamo utilizzando questo protocollo di imaging per identificare le cellule del gusto che rispondono agli amminoacidi e determinare se diversi stati interni modulano il modo in cui le cellule del gusto rispondono a questi nutrienti essenziali. Un vantaggio di questo approccio di imaging del calcio è che consente di registrare le risposte neurali indotte dal gusto da cellule specifiche in animali svegli in cui gli stati interni rimangono intatti.

Ora possiamo identificare i circuiti gustativi putativi nel nuovo connettoma dell'intero cervello di Drosophila e verificare le dinamiche neuronali funzionali in vivo utilizzando questo approccio di imaging del calcio. Per iniziare, posizionare la mosca anestetizzata sotto un microscopio da dissezione. Usando le forbici da dissezione, rimuovere le zampe medie e posteriori all'articolazione tibiale femorale e le quattro zampe al trocantere.

Raccogli la mosca per le ali usando una pinza smussata per posizionarla con la testa sopra la fessura cervicale mirata della camera di imaging mantenendo il corpo sotto. Usando il lato smussato delle forbici e la pinza smussata, spingi delicatamente la testa e il torace contemporaneamente nella fessura. Una volta che la mosca è saldamente all'interno della fessura, spingila all'indietro e riposizionala delicatamente in modo che sia rivolta verso la parte anteriore della camera.

Raccogli una piccola goccia di smalto per unghie sull'estremità di uno stuzzicadenti e applica uno strato sottile per fissare la testa della mosca alla camera di imaging. Prendi la ceretta con una mano e raccogli una piccola goccia di cera sulla punta. Usando una pinza semiaffilata, d'altra parte, afferra un palpo mascellare ed estrai delicatamente e tieni la proboscide in piena estensione.

Toccare la punta della ceretta con la camera vicino alla base della proboscide fino a quando la cera inizia a scorrere. Muoversi per entrare in contatto con la base della proboscide e incerare a metà dello stelo, evitando il contatto con i sensilli labellari. Quindi estendere completamente la proboscide il più dritta possibile.

Ora metti le mosche montate in una camera di umidità per 60 minuti per riprenderle. Rimuovi le mosche dalla camera di umidità. Usando una pinza molto affilata, pizzicare entrambe le antenne, pizzicare la cuticola per creare un foro e inserire un lato della pinza affilata.

Fai scorrere la pinza sotto la cuticola per rimuoverla dalla regione che copre l'area cerebrale di interesse. Per lavare il cervello esposto, aggiungere circa 100 microlitri di soluzione di emolinfa artificiale, o AHL, alla testa. Dopo il lavaggio, rimuovere l'AHL, lasciando uno strato sottile per evitare che il cervello si secchi.

Usando una pinza affilata, rimuovi le sacche d'aria e tutti i detriti di grandi dimensioni che coprono il cervello. Per visualizzare in modo specifico la zona subesofagea, o SEZ, tagliare l'esofago alla base vicino alla proboscide e nel punto in cui passa attraverso il cervello, utilizzando una pinza molto affilata. Rimuovi questo pezzo per esporre la ZES.

Sotto il microscopio di dissezione, posizionare il vetrino coprioggetto da 10 x 20 millimetri nella fessura angolata della camera di imaging. Caricare circa due microlitri d'acqua, o un altro controllo negativo, nel tubo capillare. Individua la mosca sezionata e concentrati sul labello utilizzando un obiettivo a immersione in aria 10x in campo chiaro.

Allineare il capillare con il labello sotto la vista 10x. Lasciare la posizione capillare direttamente davanti al labello, assicurandosi che sia vicino ma non si tocchi. Sposta il tavolino per centrare la regione del cervello di interesse.

Passa a un obiettivo a immersione in acqua con ingrandimento più elevato come l'obiettivo 40x. Aggiungere circa 200 microlitri di AHL sulla parte superiore del cervello per garantire il contatto con l'obiettivo di immersione. Passa alla potenza del laser a 488 nanometri per localizzare l'espressione di GCaMP nell'area di interesse.

Dopo aver raccolto almeno cinque secondi di fluorescenza basale, spostare manualmente lo stimolatore in modo che il capillare copra il labello per cinque secondi. Rimuovi lo stimolo e continua a catturare per tutto il tempo desiderato. Quindi, rimuovere l'AHL e tornare al campo chiaro 10x per confermare che il vetrino coprioggetti, lo stimolatore e il labello rimangano nella posizione corretta.

Quindi rimuovere la camera di imaging e utilizzare un panno privo di lanugine per rimuovere la prima soluzione dal capillare. Sciacquare la pipetta con acqua e pipettare circa due microlitri del tastant successivo nel tubo capillare. La variazione relativa della fluorescenza nei moscerini Gr64f GCaMP era significativamente più alta per la stimolazione del saccarosio rispetto all'acqua, dimostrando una risposta forte e sostenuta dei neuroni del recettore gustativo dolce.

Il picco di fluorescenza relativa per la stimolazione del saccarosio era significativamente maggiore di quello per l'acqua. La variazione di fluorescenza nei moscerini Gr66a GCaMP era significativamente più alta per la stimolazione della caffeina rispetto all'acqua, mostrando una risposta all'insorgenza e alla rimozione della caffeina. Il modello di proiezione dei terminali assonali nei moscerini Gr66a era distinto da quello di Gr64f, dimostrando la segregazione anatomica dei neuroni recettori gustativi sensibili all'amaro e allo zucchero.