胸腔内注射:成体のゼブラフィッシュの心臓への化合物送達

1. 胸腔内注射のための魚の準備

1. 成魚のゼブラフィッシュ(Danio rerio)を網で捕まえ、麻酔液に移します。
2. 1〜2分後、魚が泳ぐのをやめ、蓋の動きが減少したら、プラスチックのスプーンで魚に触れて、魚が接触に反応しないことを確認します。
3. スプーンで魚を腹側を上にして、濡れたスポンジの溝にすばやく慎重に移します。魚の頭は、オペレーターの利き手から離れている必要があります。

2. 心膜へのマイクロインジェクション

1. 実体顕微鏡の下で、魚の皮膚の下で鼓動する心臓の動きを注意深く観察します。拍動する心臓の上と腹側軟骨板によって定義される三角形の中央にある注入点を視覚的に決定します(図1D)。キャピラリーの先端を体軸に対して30〜45°の角度で挿入します(図1E)。マイクロキャピラリーの先端で皮膚を心膜に優しく浸透させます(図1C)。最適なエントリーポイントは、頭よりも腹部に近いです。
   手記：毛細血管を体や心臓に深く挿入しすぎると、臓器に損傷を与える可能性があります。心臓穿刺の場合、針は通常血液で満たされます。これが発生した場合は、毛細血管を取り外し、魚を実験から除外します。
2. 針が心膜の内側に入ったら、マイクロインジェクターデバイスのペダルを押して注射を完了します.
   手記：胸腔内に空気を注入しないように注意してください。
3. 注射後、毛細血管を胸部から静かに引き抜き、すぐに魚をシステム水の入った水槽に移して回復させます。
4. 麻酔から完全に回復するまで魚を監視します。
5. 目的の時点で心臓を採取し、さらなる分析のために準備します.
   手記：魚が30秒以内に蓋の動きを再開しない場合は、プラスチック製のピペットで鰓に水を絞って魚を蘇生させます。

図1:成体ゼブラフィッシュにおける胸腔内(IT)注射。(A)フィラメント(直径6インチ、直径1.0 mm)を備えたプルドマイクロインジェクションキャピラリーの写真と、使用したニードルプーラープログラムの値。(B)フィラメント(直径6インチ、直径1.0mm)を10%フェノールレッドを含む2.5μLの溶液で充填したプルドマイクロインジェクションキャピラリーの写真。針の引っ張られた先端の長さは最大7mmです。(C)ITインジェクション手順の概略図。(D)ITインジェクション手順の写真。この図は、Bise et al.パネルCとDの数字は、手順の同じステップに対応しています:(1)魚は腹側を上にして加湿スポンジの上に置かれます。穿刺部位(三角形の赤い点)は、えら近くの胸部の中心にあります。(2)針が心膜に浸透する。赤い点は穿刺部位を示します。(3)注射は、心膜腔内の赤い溶液の広がりを観察することによって監視されます。(E)ITインジェクションのスキーム。注射毛細血管と体軸の間の角度は、心臓の穿刺を避けるために30°から45°の間である必要があります。(F)指示された量のIT注入後1時間での魚の胸部の写真。白い矢印は赤みがかった組織を指しており、これは内出血を示している可能性があります