超音波ガイド下移植:膵管腺癌細胞を成体マウスに移植する技術

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とjove獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウスの術前準備

>注:この手順は、手順の24時間前に実行することをお勧めします。

1. 実験用マウスの入ったケージを37°Cに設定したウォーマーに置きます。
2. 新しい清潔なケージを入手し、37°Cに設定された2つ目の加温プラットフォームに置きます。
3. 生物学的安全キャビネット、誘導チャンバー、超音波(US)ステージを滅菌剤で徹底的に清掃します(材料の表を参照)。
4. USステージの加温機能を37°Cに回します。
5. 麻酔器の電源を入れます:チューブスプリッターのダイヤルを調整して、空気の流れが誘導チャンバーのみに制限されるようにします。酸素ボンベの電源を入れ、流量を1L / minに設定します。イソフルラン気化器を2〜3%にオンにします。
6. 1匹のマウスを誘導チャンバーに入れます。動きがなくなり、呼吸が遅くなるまでマウスを監視します。
7. スプリッターのダイヤルを調整して、誘導チャンバーとノーズコーンの両方に空気の流れが入るようにします。マウスを誘導チャンバーからすばやく移動させ、銃口をノーズコーンに装着して、暖かい米国のステージに腹側に横たわ
らせます。
8. つま先の挟み込みに対する反射的な反応を観察することにより、誘導のレベルをテストします。何もない場合、マウスは脱毛の準備ができています。
9. 組織の脱水を防ぐために、少量のアイ潤滑剤(材料の表を参照)を両目に置きます。マウスを回して、ステージ上の背側に横たわるようにします。上肢と下肢を紙テープでステージに優しく接着して、腹部の露出を最大化し、マウスをステージに固定します。
10. 滅菌済みのコットンチップアプリケーターを使用して、腹部の左上の象限にたっぷりの層の脱毛クリームを塗布します。脱毛剤は脾臓の一般的な領域に適用され、正中線に向かって伸びるべきです。約1分間座っておきます。
11. コットンチップアプリケーターの反対側の端を優しく使用して脱毛クリームを拭き取り、脱毛クリームが簡単に剥がれたら、乾いたガーゼパッドで腹部をきれいに拭いて、脱毛の程度をテストします。次に、ガーゼのきれいな層を少量の温かい生理食塩水で濡らし、その部分をもう一度拭いて脱毛剤を完全に取り除きます。化学火傷の可能性を減らすために、マウスの皮膚に直接触れる時間は2分を超えないようにしてください。
12. 腹部から毛が十分に取り除かれたら、マウスを暖かい新しい清潔なケージに戻します。
13. 最初の動物が米国のステージで脱毛を受けている間、次の動物を誘導チャンバーに追加することができます。
14. マウスの次のケージに麻酔をかける前に、イソフルランの電源を切り、誘導チャンバーを酸素で洗い流します。誘導チャンバーとUSステージ/ノーズコーンを滅菌剤で清掃します。手順1.5-1.14を繰り返して、すべてのケージとマウスが脱毛されるまで行います
    手記： 着床前の期間に食物を一時的に離脱させることにより動物を空腹させることは、胃や腸内の未消化の食物による腹部臓器の視覚障害を最小限に抑えると考えることができる(12-24時間)。水の制限はお勧めしません。動物が絶食している場合は、脱水症を防ぐために、腫瘍注射後に1mLの温かい(37°C)滅菌生理食塩水を注射することをお勧めします。

>2. PDA細胞の超音波ガイド下移植

>注:すべての超音波処置は、超音波画像診断装置とソフトウェアを使用して行われます(資料の表を参照)。トランスデューサの中心周波数は40MHz、帯域幅は22〜55MHzです。

1. プラットフォームの表面が床と平行になり、研究者が動物の左側を向き、動物の頭が右側になるように超音波プラットフォームを調整します。腹部横方向の画像が得られるように、トランスデューサーの位置を調整します(図1A)。
2. ステップ1.1〜1.8で説明されているように、注入するマウスに麻酔をかけます。手順1.9の説明に従って、USプラットフォームでマウスを安定させます。
3. 腹部の無毛部分に温かい(37°C)超音波ジェルをたっぷりと塗ります。
4. トランスデューサーをゆっくりと下げてマウスの腹部に接触させます。膵臓がはっきりと見えるまで、必要に応じてトランスデューサーを調整します。腹腔の正確な向きを提供するために、左腎臓と脾臓を見つけます.
   手記：トランスデューサーの位置が腹部の左側にアクセスできるように変更されたため、ステージコントロールのX軸とY軸が反転しました。
5. 29G x 1/2インチのインスリン注射器(材料の表を参照)に25μLの腫瘍細胞懸濁液をロードします。腹壁への腫瘍細胞の播種を最小限に抑えるために、注射前に滅菌アルコール調製パッドで針先を拭
いてください。
6. 鈍いエッジの鉗子を使用して、皮膚と腹膜壁をつかみ、目的の注入部位の張力を高めます。シリンジを超音波プラットフォームの表面に対して約25°〜45°の角度で保持し、針を皮膚と腹膜壁を通してゆっくりと進めます。次のステップに進む前に、針が腹膜壁に穴を開けたことを確認してください。針が腹膜壁を突き刺すときに、小さな破裂音が感じられるはずです。
7. 超音波による視覚化の下で、針を直接膵臓に導きます(図1B-C)。注射器のバレルをゆっくりと上下に動かして、針が膵臓組織内にあることを確認します。配置が正しい場合、シリンジのバレルが動いている間、針先は膵臓組織内に留まります。
8. 腫瘍細胞をゆっくりと注入し、膵臓内に液体ボーラスが形成されることにより、細胞が目的の場所に移植されていることを確認します(超音波スクリーンで確認できる、図1D).
   手記：プランジャーを押すときには、ある程度の抵抗を感じる必要があります。膵臓に何度も穴を開けると腹腔内に漏れる可能性が高くなるので注意してください。
9. 懸濁液の全量が注入され、膵臓に液体ボーラスが見られるようになったら、針を数秒間静止させてください。マウスの腹部から針をゆっくりと引っ込め、注入した細胞を乱さないように細心の注意を払います。
10. マウスを清潔で暖かいケージに入れ、マウスが麻酔から完全に回復することを確認します。このプロセスをすべての動物に対して繰り返します。
11. 次のマウスに麻酔をかける前に、誘導チャンバーとUSステージ/ノーズコーンを滅菌剤で清掃します。
12. すべてのマウスが注入されるまで、手順2.2〜2.11を繰り返します。

図1:マウス膵臓へのPDA細胞の超音波ガイド下移植。(A)腹部臓器の高解像度画像を取得するために使用したマウス、超音波ステージ、および超音波プローブの向き。ステージとプラットフォームは、マウス腹部の左上の象限に簡単にアクセスできるように、標準の向きから90°回転していることに注意してください。(B)腎臓、脾臓および膵臓の同定を描いた超音波画像。ここでは、注射針がマウスの腹部に配置されています。(C)マウスの膵臓内の針を描いた超音波画像。(D)腫瘍細胞の膵臓への制御された注射後の注入部位の気泡(青で囲まれた)を描いた超音波画像。(E)超音波ガイド下注射後の膵臓にPDA細胞を含む液体ボーラスを明らかにする開腹術。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。