同所性ホモグラフト腫瘍移植:膵臓腫瘍マウスモデル作製技術

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 腫瘍移植の準備

1. アニマルハウジング
   1. ジェネリックのC57BL/6マウスは、市販の繁殖業者から入手してください。
   2. 次の条件で個々の換気ケージ内のイエネズミ(5):温度:20〜26°C、湿度30〜70%、照明サイクル:12時間明るい、12時間暗い。
   3. 毎週交換されるトウモロコシの穂軸の寝具を使用してください。
   4. 食事については、研究期間全体を通して照射滅菌された乾燥顆粒食品を提供します。
   5. 水については、動物が滅菌済みの飲料水に無料でアクセスできるようにします。
2. ドナー腫瘍断片の調製
   1. まず、天秤を使用した体重測定による体重測定による体重 (BW) のモニタリングと、キャリパー測定による腫瘍体積 (TV) のモニタリングから始めます。
   2. TVが500〜1,200 mm³に達したら、プロトコルに従って動物をバイオハザードフードで安楽死させます。
   3. ヨードフォア綿棒を使用して腫瘍の周りの皮膚を滅菌します。
   4. プロトコルに従って腫瘍を外科的に切除します。
   5. 終了前に、目視および触診により、触知可能な腫瘍の存在を検査します。
   6. 終了するには、最初に承認されたプロトコルに従ってマウスを安楽死させ、腹部を開いて膵臓の腫瘍を視覚的に調べます。
   7. 死後の手術で腫瘍を切り取り、冷たいPBSに加えます。すべての動物を、使用する二酸化炭素を送達するためのポートを備えた特別な蓋を備えた、清潔で充電されていない半透明の安楽死チャンバーに入れます。
   8. 動物への苦痛を最小限に抑えながら、急速な意識喪失を引き起こす流量でガスをチャンバーに排出します。CO₂ の最適な流量は、約 2 〜 2.5 L/min です。
   9. 安楽死処置中に各動物を視覚的に観察して、すべての動物が適切なガス濃度を受け取り、安楽死処置中に意識を取り戻さないことを確認します。
   10. 動物が回復する可能性を最小限に抑えるために、明らかな臨床的死亡後少なくとも1分間はガスの流れを維持します(無呼吸であるが死亡していない場合)。.
   11. 隣接する非腫瘍組織を切除します。洗浄された腫瘍は素早く撮影できます.
       腫瘍組織をRPMI-1640に入れ、解離する前に氷上に保管します.
       手記：動物の死骸は袋詰めされ、適切な冷凍庫に保管され、取り出しを待ちます。
   12. 腫瘍を20 mLのPBSを含むシャーレに入れます(動物を安楽死させる前に、培地または緩衝液を4°Cに予冷します)。
   13. 汚染された血液がある場合は、腫瘍を別のペトリ皿に移し、PBSで腫瘍を洗浄します。
   14. 腫瘍を半分に切り、余分な皮膚、血管、石灰化、および/または壊死を取り除きます。
   15. 腫瘍の無傷の部分のみを選択し、滅菌済みの50 mL遠心チューブに入れ、20 mLのPBSを加えてから、チューブを別の動物室に運び、薬理学研究を行います。

2. 膵臓同所性移植

1. 麻酔と鎮痛
   1. 2 mLのケタミン注射と0.42 mLのキシラジン注射(20 mg / mL)を5.91滅菌注射水または生理食塩水に混合し、0.06〜0.1 mL / 20〜25 gの用量で体重を使用します
      注:動物愛護団体によると、術前と術後の両方で鎮痛剤が必要です。0.05〜0.1 mgのブプレノルフィン/ kg、SC。最初の投与は手術前であり、その後、手術後4時間ごとに3回継続的に投与されます。
2. 同所性移植のための外科手術
   1. 筋肉内注射(IM)によるマウスの麻酔。レシピエント動物に5%イソフルランを麻酔し、これはノーズコーンによって1%に維持されます。動物はリラックスし始め、直立反射を失い、最終的には動かなくなります。この麻酔の深さでは、彼らは痛みを伴う刺激によって容易に目覚めることができます。痛みに対するそのような反応がなくなるまで、麻酔を深くします。
   2. 動物に完全に麻酔をかけた後、マウスを実験ボード上の右横位置に固定します。
   3. マウスを正しい横位置に保ちます。脾臓の周りの皮膚をヨウ素で消毒し、次に75%エチルアルコールで脱ヨウ素化します。
   4. 脾臓の中点を見つけ、腹部に1cmの垂直切開をして脾臓を露出させます。
   5. 脾臓の下の膵臓組織の一部をフラットチップで優しく引き出し、シードマウスのマウスからマウスホモグラフト腫瘍片をレシピエントマウスの膵臓に9-0吸収性外科縫合糸で縫合します。
   6. ダブルシームによる6-0シルク縫合糸で腹部を閉じます。圧縮によってホメオスタシスを達成します。
   7. 腫瘍移植終了後、出血や腫瘍組織の漏出が起こらない場合は、動物を温かいケージに入れてください。
   8. 動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物を観察し、麻酔から完全に回復した後、動物を動物室に戻します。脾臓近くの腹部を触診して腫瘍発生マウスをモニターし、同所性腫瘍発生マウスを選抜します。

>3. 担がんマウスの健康モニタリング

1. 水と食物の消費量を毎日確認してください。
2. 手入れされていない毛皮、しこり、薄さ、異常な息、腹水などがないか、マウスの外観を調べます。
3. 腹部を触診して、肝臓や脾臓に自然発生的な腫瘍があるかどうかを確認します。
4. 天びんを使用して毎週マウスの体重を量ります。
5. 以下の臨床徴候のいずれかが観察された場合、マウスはサンプル収集と剖検のために犠牲になります: BW 損失 >20%)、運動障害 (飲食ができない)、著しい腹水症と腹部の肥大により正常に動くことができない、呼吸の努力。