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Abstract

出典:Merenda, A. et al., A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、CRISPRコンカテマーを使用して、培養マウス腸オルガノイド細胞の複数の遺伝子を同時にノックアウトする遺伝子ノックアウト技術について説明しています。この方法は、病気の遺伝子をノックアウトし、遺伝子の機能とそのパラローグを解明するために使用されます。

Protocol

1. CRISPR連結子ベクターのgRNA設計

<p class="jove_content">注:このセクションの目的は、最適なターゲティング戦略を選択する方法と、CRISPRコンカテマーベクターの特定のオーバーハングを含むgRNAを設計する方法を説明することです。

1. 選択したCRISPR gRNAデザインツールを使用して、目的の遺伝子に対するgRNAを設計します。例については、材料の表を参照してください。
   手記：パラロカス遺伝子のペアを標的とする場合、遺伝子ごとに1つのgRNAを設計することは可能ですが、ダブルノックアウトを達成する可能性を高めるためには、遺伝子ごとに2つのgRNAを設計することをお勧めします(図1)。
2. 制限マッピングツールを使用して、gRNAにBbsI認識部位が含まれていないことを確認します(例については、材料の表を参照)。
3. 表1に示すように、特定のCRISPRコンカテマーベクターオーバーハングを各オリゴに加えます。

2. CRISPR連結体ベクターへのgRNAのクローニング

1. オリゴのリン酸化とアニーリング
   手記：このステップでは、各gRNAオリゴの上部と下部の鎖をアニールする方法と、1回の反応でそれらの末端をリン酸化する方法を示します。
   1. オリゴをリン酸化し、氷上で上鎖と底鎖をアニーリングするための反応混合物を、以下の手順に従って調製します
      手記：すべてのオリゴは1つの反応にプールできます。例えば、4 gRNAコンカテマーベクターの場合、8つのオリゴをプールします。
   2. 3つのコンカテマーの場合、3.0 μL gRNAトップストランド(各gRNAから1.0 μL、10 μM、1 μL/gRNA)、3.0 μL gRNAボトムストランド(各gRNAから1.0 μL、10 μM、1 μL/gRNA)、2.0 μL T4 DNAリガーゼバッファー(10x)、1.0 μL T4 PNKを使用し、H₂Oを合計20.0 μLまで追加します。
   3. ピペッティングでよく混合し、次の設定を使用してサーモサイクラーでこれを実行してください:37°Cで30分間、95°Cで5分間、0.3°C/minで25°Cまでランプダウンし、4°Cで保持します。
2. BbsI シャッフル リアクション
   手記：このセクションでは、アニーリング済みのgRNAオリゴを、消化とライゲーションを交互に繰り返すことにより、1ステップでコンカテマーベクターの適切な位置に取り込まれます。
   1. 反応混合物をDNase/RNaseフリー水で1:100に希釈し、3および4 gRNAコンカテマーベクターを生成します
      手記：2 gRNAコンカテマーをクローニングする場合、このステップは必要ありません。
   2. 以下の指示に従って、BbsI shuffling 反応を氷上で組み立てます。ベクトルのみを含むネガティブコントロールを含めます。
   3. 100 ng CRISPRコンカテマーベクター、10.0 μLオリゴ混合物、1.0 μL BSA含有制限酵素バッファー(10x)、1.0 μL DTT(10 mM)、1.0 μL ATP(10 mM)、1.0 μL BbsI、1.0 μL T7リガーゼ、およびH₂Oを総容量20.0 μLまで使用してください。
   4. ピペッティングでよく混合し、サーモサイクラーで以下の設定で泳ぎます:3gRNAコンカテマーと4gRNAコンカテマーのクローニングに50サイクル、2gRNAコンカテマーに25サイクル、どちらも37°Cで5分間、21°Cで5分間、37°Cで15分間保持し、その後4°Cで永久に保持します。
3. エキソヌクレアーゼ治療
   手記：このステップは、直鎖状化されたDNAの痕跡を除去することによりクローニングの効率を向上させるため、強く推奨されます。
   1. BbsIシャッフル反応をDNAエキソヌクレアーゼ(材料表を参照)で次のように扱います。
   2. 前のステップ(2.2.3)の11.0 μLライゲーションミックスを取り、1.5 μLのエキソヌクレアーゼバッファー(10x)、1.5 μL ATP(10 mM)、1.0 μL DNAエキソヌクレアーゼを加え、水で総容量を15.0 μLまで上げます。37°Cで30分間インキュベートし、続いて70°Cで30分間インキュベートします
      手記：このステップにより、混合物中に残存する直鎖状DNAが除去されるため、クローニング効率が向上します。
   3. 反応混合物2μLを使用して、熱ショックにより化学的にコンピテントな大腸菌に形質転換します
      注:あるいは、反応を-20°Cで最大1週間保存することもできます。

3. エレクトロポレーションによる腸内オルガノイドのトランスフェクション

<p class="jove_content">注:この手順は、2015年に藤井らによって発表された、マウスの小腸オルガノイド培養への適応に関するプロトコルに基づいていることに注意してください。

1. プレエレクトロポレーション
   手記：このセクションでは、エレクトロポレーションの前にマウスの腸管オルガノイドを調製する方法を説明します。マウスの培養液からすべての抗生物質とコンディショニング培地を除去します。これにより、エレクトロポレーション中に起こりうる毒性の影響を防ぐことができます。
   1. トランスフェクション手順の0日目に、オルガノイドを1:2の比率で分割します.
      注:腸オルガノイド培養は、以前に確立されたプロトコルに従って陰窩単離を行うことによって得ることができる。すべての培地組成については、表2を参照してください。
      1. エレクトロポレーションのためにオルガノイドを分割する場合は、トランスフェクションごとに48ウェルプレートのウェルを最低6個播種します。
      2. オルガノイドを20 μLの地下マトリックス滴に播種し、加湿インキュベーター(前述)で37°C、5%CO₂のWENR + Nic培地(Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide)で成長させます。
   2. 2日目に、WENR+Nicを250μLのEN(EGF + Noggin)+CHIR99021(グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3阻害剤)+Y-27632(ROCK阻害剤)に交換し、抗生物質を含まない(表2参照)
      注:すべてのステップで、48ウェルプレートの各ウェルに添加される培地の量は250μLです。
   3. 3日目に、オルガノイド培地を抗生物質を使用せずにEN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v / vジメチルスルホキシド(DMSO)に変更します。
2. 細胞の準備
   手記：ここでは、オルガノイドを機械的および化学的解離によって小さな細胞クラスターに断片化する方法について説明します。これらの手順は、手順の成功に不可欠です。
   1. 4日目に、1 mLのピペットチップを使用して地下のマトリックスドームを破壊し、オルガノイドを1.5 mLチューブに移します。48ウェルプレートの4つのウェルをチューブにプールした内容物。
   2. オルガノイドを機械的に小さな断片に分解するには、P200ピペットで約200回ピペッティングします。室温で600 x gで5分間遠心分離します。
   3. 培地を取り出し、ペレットを細胞培養グレードの組換えプロテアーゼ1 mLに再懸濁します(材料の表を参照)。37°Cで最大5分間インキュベートした後、4倍対物レンズを搭載した倒立光学顕微鏡で50μLのサンプル滴を確認します。.
      手記：10〜15個の細胞のクラスターは、エレクトロポレーション後の細胞生存率を高めるため、望ましいです。
   4. 細胞懸濁液を低結合性の15 mLチューブに移し、抗生物質を含まない9 mLの基礎培地を添加して解離を停止します(表2を参照)。室温で600 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを1 mLの還元血清培地に再懸濁します(材料の表を参照)。
   5. ビュルカーチャンバーで細胞の数を数え、エレクトロポレーション反応ごとに最低1 x 10⁵個の細胞を使用します。9 mLの減液培地を15 mLチューブに加え、室温で400 x gで3分間遠心分離します。
3. エレクトロポレーション
   手記：次のセクションでは、エレクトロポレーションの実施方法と、その後のオルガノイドの回復方法について説明します。
   1. すべての上清を取り除き、ペレットをエレクトロポレーション溶液に再懸濁します(材料の表を参照)。細胞懸濁液に合計10 μgのDNAを加え、最終容量100 μLにエレクトロポレーション溶液を加えて、細胞-DNA混合物を氷上に保ちます。CRISPRコンカテマーベクターをCas9発現プラスミド (Addgene #41815など) と組み合わせて、1:1の比率で使用してください><。 手記：添加するDNAの総量は、全反応量の10%以下でなければなりません。
   2. トランスフェクション効率を評価するために、GFPプラスミドを含む別のトランスフェクションミックスを含めてください (例:pCMV-GFP、Addgene #11153、または任意の汎用GFP発現プラスミド)。
   3. 細胞-DNA混合物をエレクトロポレーションキュベットに加え、エレクトロポレーターチャンバーに入れます。エレクトロポレーターの適切なボタンを押してインピーダンスを測定し、0.030〜0.055kΩであることを確認します。表3.
      に示す設定に従ってエレクトロポレーションを行います 手記：インピーダンス値が許容範囲外の場合は、キュベット内の溶液量を調整します。
   4. 400 μLのエレクトロポレーションバッファー+ Y-27632をキュベットに加え、すべてを1.5 mLチューブに移します。室温で30分間インキュベートして細胞を回復させ、続いて室温で400 x gで3分間回転させます。
   5. 上清を取り除き、ペレットを地下マトリックスの20μL /ウェルに再懸濁します。48ウェルプレートでウェルあたり約1 x 104〜1 x 105細胞を播種し、EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v / v DMSO培地を添加します。37°Cでインキュベートします。
   6. 5日目に、培地をEN + CHIR99021 + Y-27632に変更し、GFP発現を観察してトランスフェクション効率を確認します(図2)。オルガノイドを37°Cに保ち、2日後にEN + CHIR99021 + Y-27632培地をリフレッシュしてください。
   7. 9日目に培地をWENR + Nic + Y-27632に変更し、37°Cでインキュベートします
      手記：Y-27632は7-10日後(16-19日)に取り外すことができます。

	カセット1	カセット2	カセット3	カセット4
シーケンス(5′-3′)	CACCGG[gRNA1]GT	ACCGG[gRNA2]G	CCGG[gRNA3]	ACACCGG[gRNA4]GTT
シーケンス(5′-3′)	TAAAAC[RC-gRNA1]CC	AAAAC[RC-gRNA2]C	AAAC[RC-gRNA3]	CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG

表1:CRISPRコンカテマベクターの各カセットのオーバーハング。

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基礎媒体		コメント
4°Cで4週間保存
細胞培養培地	500ミリリットル	資料の表を見る
L-グルタミン	100×5 mL
バッファリング剤 1 M	5ミリリットル	資料の表を見る
ペニシリンストレプトマイシン	100×5 mL
WENR + Nic(Wnt + EGF + Noggin + Rspondin +ニコチンアミド)
4°Cで2週間保存
基礎媒体	50mLまで
神経細胞無血清サプリメント(50x)	1 mL	資料の表を見る
ニューロン細胞無血清サプリメント(100x)	500μL	資料の表を見る
n-アセチルシステイン(500 mM)	125μL
マウスEGF(100μg/mL)	25μL
マウスNoggin(100 μg/mL)	50 μL
R-Spondin馴染培地	5ミリリットル
Wnt3a馴染培地	25ミリリットル
ニコチン酸アミド (1 m)	250μL
EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632)
4°Cで2週間保存
基礎媒体 w/o ペニシリン ストレプトマイシン	20mLまで
神経細胞無血清サプリメント(50x)	400μL	資料の表を見る
ニューロン細胞無血清サプリメント(100x)	200μL	資料の表を見る
n-アセチルシステイン(500 mM)	50 μL
マウスEGF(100μg/mL)	10 μL
マウスNoggin(100 μg/mL)	20μL
Y-27632 (10 μM)	20μL
CHIR99021 (8 μM)	10 μL
EN(EGF+ノギン)
4°Cで4週間保存
基礎媒体	50mLまで
神経細胞無血清サプリメント(50x)	1 mL	資料の表を参照してください
ニューロン細胞無血清サプリメント(100x)	500μL	資料の表を参照してください
n-アセチルシステイン(500 mM)	125μL
マウスEGF(100μg/mL)	25μL
マウスNoggin(100 μg/mL)	50 μL

<p class="jove_content">表2:オルガノイド培地の組成。

	ポーリングパルス	トランスファーパルス
電圧	175V	20V
パルス長	5ミリ秒	50ミリ秒
パルスインターバル	50ミリ秒	50ミリ秒
パルス数	2	5
減衰率	10%	40パーセント
極性	+	+/-

<p class="jove_content">表3:エレクトロポレーション設定。

Representative Results

Materials

Optimized CRISPR Design Tool 	Feng Zhang group 		CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/
Webcutter 2.0 			restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) 	New England Biolabs 	M0201L
T4 DNA ligase buffer 	New England Biolabs 	M0202S
T7 DNA Ligase 	New England Biolabs	 M0318L
DTT (dithiothreitol) 	Promega 	P1171
ATP (adenosine triphosphate) 	New England Biolabs 	P0756S
FastDigest BbsI (BpiI) 	Thermo Fisher 	FD1014
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer)	Thermo Fisher 	BY5
BglII 	New England Biolabs 	R0144
EcoRI 	New England Biolabs 	R0101
Plasmid-safe exonuclease 	Cambio 	E3101K
Thermal cycler 	Applied biosystems 	4359659
10G competent E. coli bacteria 	Cambridge Bioscience 	60108-1
Advanced DMEM/F12(cell culture medium)	Invitrogen 	12634-034
Glutamax (L-Glutamine) 	100x Invitrogen 	35050-068
HEPES 1 M (buffering agent) 	Invitrogen 	15630-056
Penicillin-streptomycin 100x 	Invitrogen 	15140-122
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x	Invitrogen 	17504-044
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x	Invitrogen 	17502-048
n-Acetylcysteine 500 mM 	Sigma-Aldrich 	A9165-5G
Mouse EGF 500 μg/mL 	Invitrogen Biosource 	PMG8043
Mouse Noggin 100 μg/mL 	Peprotech	 250-38
Nicotinamide 1 M 	Sigma 	N0636
R-Spondin conditioned medium 	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013
Wnt conditioned medium	n.a. 	n.a. 	Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014
Y-27632 10 μM 	Sigma-Aldrich 	Y0503-1MG
Standard BD Matrigel matrix 	BD Biosciences	356231
48-well Plate 	Greiner Bio One 	677980
CHIR99021 	Sigma-Aldrich 	A3734-1MG
IWP-2 	Cell Guidance Systems 	SM39-10
TrypLE (recombinant protease)	 Invitrogen 	12605-010
Opti-MEM (reduced serum medium)	Life technologies	 51985-034
Electroporation Cuvettes 2 mm gap 	NepaGene 	EC-002S
Low binding 15 mL tubes 	Sigma-Aldrich 	CLS430791
Bürker’s chamber 	Sigma-Aldrich	 BR719520-1EA
NEPA21 Super Electroporator 	NepaGene 	contact supplier
Protein LoBind tubes low binding	Thermo Fisher 	10708704
BTXpress electroporation buffer 	Harvard Apparatus 	45-0805
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	 AppliChem	 A3672