出典:Merenda, A. et al., A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer. J. Vis. Exp. (2017).
このビデオでは、CRISPRコンカテマーを使用して、培養マウス腸オルガノイド細胞の複数の遺伝子を同時にノックアウトする遺伝子ノックアウト技術について説明しています。この方法は、病気の遺伝子をノックアウトし、遺伝子の機能とそのパラローグを解明するために使用されます。
1. CRISPR連結子ベクターのgRNA設計
<p class="jove_content">注:このセクションの目的は、最適なターゲティング戦略を選択する方法と、CRISPRコンカテマーベクターの特定のオーバーハングを含むgRNAを設計する方法を説明することです。2. CRISPR連結体ベクターへのgRNAのクローニング
3. エレクトロポレーションによる腸内オルガノイドのトランスフェクション
<p class="jove_content">注:この手順は、2015年に藤井らによって発表された、マウスの小腸オルガノイド培養への適応に関するプロトコルに基づいていることに注意してください。カセット1 | カセット2 | カセット3 | カセット4 | |
シーケンス(5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | CCGG[gRNA3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
シーケンス(5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
表1:CRISPRコンカテマベクターの各カセットのオーバーハング。
基礎媒体 | コメント | |
4°Cで4週間保存 | ||
細胞培養培地 | 500ミリリットル | 資料の表を見る |
L-グルタミン | 100×5 mL | の|
バッファリング剤 1 M | 5ミリリットル | 資料の表を見る |
ペニシリンストレプトマイシン | 100×5 mL | の|
WENR + Nic(Wnt + EGF + Noggin + Rspondin +ニコチンアミド) | ||
4°Cで2週間保存 | ||
基礎媒体 | 50mLまで | |
神経細胞無血清サプリメント(50x) | 1 mL | の資料の表を見る |
ニューロン細胞無血清サプリメント(100x) | 500μL | 資料の表を見る |
n-アセチルシステイン(500 mM) | 125μL | |
マウスEGF(100μg/mL) | 25μL | |
マウスNoggin(100 μg/mL) | 50 μL | |
R-Spondin馴染培地 | 5ミリリットル | |
Wnt3a馴染培地 | 25ミリリットル | |
ニコチン酸アミド (1 m) | 250μL | |
EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) | ||
4°Cで2週間保存 | ||
基礎媒体 w/o ペニシリン ストレプトマイシン | 20mLまで | |
神経細胞無血清サプリメント(50x) | 400μL | 資料の表を見る |
ニューロン細胞無血清サプリメント(100x) | 200μL | 資料の表を見る |
n-アセチルシステイン(500 mM) | 50 μL | |
マウスEGF(100μg/mL) | 10 μL | |
マウスNoggin(100 μg/mL) | 20μL | |
Y-27632 (10 μM) | 20μL | |
CHIR99021 (8 μM) | 10 μL | |
EN(EGF+ノギン) | ||
4°Cで4週間保存 | ||
基礎媒体 | 50mLまで | |
神経細胞無血清サプリメント(50x) | 1 mL | の資料の表を参照してください |
ニューロン細胞無血清サプリメント(100x) | 500μL | 資料の表を参照してください |
n-アセチルシステイン(500 mM) | 125μL | |
マウスEGF(100μg/mL) | 25μL | |
マウスNoggin(100 μg/mL) | 50 μL |
ポーリングパルス | トランスファーパルス | |
電圧 | 175V | 20V |
パルス長 | 5ミリ秒 | 50ミリ秒 |
パルスインターバル | 50ミリ秒 | 50ミリ秒 |
パルス数 | 2 | 5 |
減衰率 | 10% | 40パーセント |
極性 | + | +/- |
The authors have nothing to disclose.
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) | 100x Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 μg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 μg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2014 |
Y-27632 10 μM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2 mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |