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Abstract

出典: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオでは、免疫沈降したライセートの化学発光に基づくウェスタンブロッティングについて説明しています。この技術は、タンパク質のプロセシングと活性化を決定するのに役立ちます。検出される化学発光シグナルは、その活性化中のタンパク質プロセシングのレベルに比例します。

Protocol

T細胞実験は、倫理協定42502-2-1273 Uni MDに従って行われました。

1. 実験のための細胞の準備

<p class="jove_content">注:この免疫沈降の平均細胞数は1 × 10⁷です。付着細胞は、実験の日に1×10⁷個の細胞が存在するように、実験の1日前に播種する必要があります。

1. 実験のための接着細胞の調製
   1. 実験開始の1日前に、14.5cm皿の各条件について、20mLの培地(組成については材料の表を参照)に5〜8×10個の⁶つの接着細胞を播種します。
   2. 実験当日は、細胞が80〜90%コンフルエントで、ディッシュに付着していることを確認してください。培地を廃棄し、接着細胞に新鮮な培地を加えます。
2. 実験のための浮遊細胞の準備
   1. 実験開始直前に、14.5 cm皿の条件ごとに、10 mLの培地(組成については材料表を参照)に1個×10個の浮遊細胞を慎重に配置します。
   2. 初代細胞を使用する場合は、前述の手順に従って初代T細胞を単離します。初代T細胞を1 μg/mLの植物血球凝集素で24時間処理し、続いて25 U/mLのIL2を6日間処理します。
   3. 実験開始直前に、14.5cm皿の条件ごとに10mLの培地(組成については材料の表を参照)に1×10個の8個の初代T細胞を慎重に配置します
      手記：初代T細胞は小さいため、この数が多いことが推奨されます。

2. CD95L刺激

1. CD95L(前述のとおりに製造されたもの、または市販されているもの(材料表参照))で細胞を刺激する
   手記：CD95Lの濃度と刺激時間は細胞の種類に依存します。1つの刺激条件を2回準備して、「ビーズコントロール」サンプルを並行して生成します。
   1. 選択した濃度のCD95Lで接着細胞を刺激します。プレートを斜めに保持し、接着細胞に触れずにリガンドを培地にピペットで移します。
   2. リガンド溶液を細胞懸濁液にピペットで移すことにより、CD95Lで浮遊細胞を刺激します。

3. 細胞の採取と溶解

1. セルディッシュを氷の上に置きます.
   手記：媒体を捨てないでください。死にかけている細胞は培地中に浮遊しており、分析に重要です。
2. 細胞懸濁液に10 mLの冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、付着した細胞をプレートからこすり落とします。細胞懸濁液を50mLのチューブに集めます。
3. 細胞皿を10 mLの冷たいPBSで2回洗浄し、洗浄溶液を同じ50 mLチューブに入れます。細胞懸濁液を500 × gで5分間、4°Cで遠心分離します。
4. 上清を捨て、細胞ペレットを1mLの冷たいPBSで再懸濁します。細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。
5. 細胞懸濁液を500 × gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットを1 mLの冷たいPBSで再懸濁します。
6. 細胞懸濁液を500 × gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを1 mLの溶解バッファー(4%プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む)で再懸濁します。氷上で30分間インキュベートします。
7. ライセートを最大速度(~17,000 × g)で15分間、4°Cで遠心分離します。
8. 上清(ライセート)をきれいなチューブに移します。ペレットを捨てます。ライセート50μLを別のチューブに取ります。Bradfordアッセイでタンパク質濃度を分析し、バイアル中の25μgのタンパク質に対応するライセートの量を取ります。ローディングバッファー(組成については材料の表を参照)をバイアルに加えます。ライセートコントロールとして-20°Cで保存してください。

4. 免疫沈降 (IP)

1. 2 μLの抗APO-1抗体と10 μLのプロテインAセファロースビーズ(メーカーが推奨するように調製)をライセートに加えます。ライセート(刺激サンプル)が入った別のチューブにビーズを10 μLだけ加えると、「ビーズコントロール」が生成されます。
   手記：開口部の広いピペットチップは、チップをカットするか、プロテインAセファロースビーズを取り扱う際にIP用の特別なチップを購入して使用します。
2. ライセートと抗体/プロテインAセファロースビーズの混合物を4°Cで一晩穏やかに混合してインキュベートします。ライセートと抗体/プロテインAセファロースビーズを500 × gで4分間、4°Cで遠心分離します。上清を捨て、ビーズに冷たいPBS1 mLを加え、このステップを少なくとも3回繰り返します。
3. 上清を捨てます。ビーズを吸引するには、できれば50μLのハミルトンシリンジを使用してください。

5. ウェスタンブロット

1. ビーズに20 μLの4倍ローディングバッファー(組成については材料表を参照)を加え、95°Cで10分間加熱し、ライセートコントロールを95°Cで5分間加熱します。
2. ライセート、IP、およびタンパク質標準試料を12.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲルにロードし(ゲル調製については、材料表を参照)、80 Vの定電圧で運転します。
3. SDSゲルからタンパク質をニトロセルロースメンブレンに移します.
   手記：ここでは、目的のタンパク質に最適化されたセミドライ技術を使用して、12 分間(25 V; 2.5 A= 一定)以上の転写を行いました。ニトロセルロースメンブレンと2つのミニサイズトランスファースタックを電気泳動バッファー(組成については材料表を参照し、製造元の指示に従って調製)に数分間浸してから、ウェスタンブロッティングを行います。
4. ブロットしたメンブレンを箱に入れ、ブロッキング溶液(0.1% Tween-20 in PBS(PBST)+ 5% milk)で1時間ブロッキングします。メンブレンをブロッキング溶液と穏やかに攪拌しながらインキュベートします。
5. メンブレンをPBSTで3回、各洗浄で5分間洗浄します。

6. ウェスタンブロット検出

1. 示された希釈率(材料表を参照)で最初の一次抗体をメンブレンに添加し、穏やかに攪拌しながら4°Cで一晩インキュベートします。
2. メンブレンをPBSTで3回、各洗浄で5分間洗浄します。
3. メンブレンを20 mLの二次抗体(PBSTで1:10,000に希釈+ 5%牛乳)と室温で1時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。
4. メンブレンをPBSTで3回、各洗浄で5分間洗浄します。
5. PBSTを廃棄し、約1 mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ基質をメンブレンに加えます。.
6. 化学発光シグナルを検出します(材料の表を参照).
   手記：露光時間とキャプチャされた画像の数は、細胞内のタンパク質の量と使用する抗体の特異性によって異なります。これは、検出に使用される各抗体について経験的に確立する必要があります。

Materials

12.5% SDS gel	Self-made		For two separating gels: 3.28 mL distilled H<sub>2</sub>O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 &micro;L 10% SDS 100 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H<sub>2</sub>O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 &micro;L 10% SDS 25 &micro;L 10% APS 7.5 &micro;L TEMED
14.5 cm cell dishes	Greiner	639160
Acrylamide	Carl Roth	A124.1
Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice	VWR	46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe)	Used for pipetting beads to the lysate
Used for pipetting beads to the lysate	Sigma Aldrich	A2103	Dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-APO-1 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-805-038-C100	Used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-3 Ab	Cell signaling	9662 S	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-caspase-8 Ab C15	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-242-C100	Dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	sc-715	Dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-c-FLIP NF6 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-804-961-0100	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-FADD 1C4 Ab	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ADI-AAM-212-E	Dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
anti-PARP Ab	Cell signaling	9542	Dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN<sub>3</sub>
APS	Carl Roth	9592.3
&beta;-mercaptoethanol	Carl Roth	4227.2
Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	Used according to manufacturer's instructions
CD95L	Provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO	ALX-522-020-C005
Chemiluminescence detector Chem Doc XRS+	Bio Rad
Complete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	PAN Biotech	P04-53500	Dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
Electrophoresis buffer	Self-made		10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H<sub>2</sub>O 1:10 dilution before usage
Glycine	Carl Roth	3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP	SouthernBiotech&nbsp;	1070-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	For activation of T cells
KCl	Carl Roth	6781.2
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Carl Roth	3904.1
Loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mL	Bio Rad	161-0747	Prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate	Millipore	WBLUFO500
Lysis buffer	Self-made		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O
Medium for adherent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L	PAN Biotech	P04-41154	Adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
Medium for primary T cells	gibco by Life Technologie	21875034	Adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
Milk powder	Carl Roth	T145.4
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	Self-made		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 8 g KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> Copyright &copy; 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H<sub>2</sub>O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk	Self-made		50 g milk powder + 1 L PBST
PHA	Thermo Fisher Scientific	R30852801	For activation of T Cells
Power Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	Use between 3-5 &micro;L
Protein A Sepharose CL-4B beads	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
Scraper	VWR	734-2602
SDS	Carl Roth	4360.2
Shaker	Heidolph
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer	Bio Rad	10026938	Prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane	Bio Rad	170-4270	Used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Chem Solute	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	3051.4
Tween-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000