マウス脳へのヒト神経前駆細胞の移植

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 移植手順

1. 手術の準備
   1. 手術器具の洗浄と滅菌を行います。
   2. 定位固定装置とマイクロインジェクションポンプシステムを準備します。
      注:開始する前に、ハミルトンシリンジと30 G、2インチ針をテストすることが重要です。滅菌された0.9%NaCl(塩化ナトリウム)が入ったチューブに針を挿入し、溶液をゆっくりと出し入れします。
   3. 麻酔器をセットアップします。動物を巻き込む前に機械をテストしてください。誘導チャンバーを70%エタノールで洗浄します。
2. 動物の調製
   マウスを順
   1. 応させるために、実験前に少なくとも7日間マウスを標準条件で保持してください。
      注:このプロトコルには、次の動物を使用しました:雌のNOD / SCID / IL2rγnull(30〜35 g、NSGとしても知られる)および雌のC57BL / 6J(20〜25 g、B6としても知られています)。この手順は、雄のマウスでも実行できます。
   2. マウスの体重を測定し、注射する鎮痛剤の用量を調整します。カルプロフェン(5 mg / kg体重)を腹腔内に投与して、痛みを軽減し、炎症反応を防ぎます。
   3. 酸素中で気化させたイソフルラン(導入期で3%、手術中の維持期で1.5〜2%)を使用して動物を麻酔します。
      注:外科的処置後の迅速な覚醒と麻酔ガスのレベルを簡単に調整できるため、ガス麻酔が好ましい。
   4. 侵害受容反射を使用して、動物が深く麻酔されていることを確認してください(つま先をつまむなど)。深い麻酔に達したら、動物を誘導室から定位固定フレームに運びます。フェイスマスクを使用して麻酔を維持します。
      注:呼吸数は、手順全体を通して視覚的に監視する必要があります(毎分40〜60回の呼吸)。処置中の低体温症を避けるために、加温パッドを使用してください。
   5. 目の乾燥を防ぐために眼科用潤滑剤を塗布してください。
   6. 電気カミソリでマウスの頭皮を剃り、綿棒を使用して5%ベタジン溶液で皮膚を消毒します。
   7. マウスヘッドを固定し、イヤーバーを外鼻道に挿入します。
      注意: 鼓膜を傷つけないように注意してください。イヤーバーを挿入する前に、両方の外耳道にリドカイン軟膏を塗布します。動物の頭が安定した位置にあるかどうかを確認するには、頭を慎重に押し下げて動きがあるかどうかを確認します。動きが見られる場合は、イヤーバー、ノーズピースの配置、またはその両方が正しくないため、再調整する必要があります。
3. 開頭術
   1. 外科用ブレードを使用して、ラムダとブレグマのランドマークを明らかにするのに十分な大きさの正中線に沿って切り込みを入れます。
      注:頭蓋骨を露出させておくために、皮膚レトラクターを適用できます。
   メ
   2. スで骨膜と筋膜を引っ込め、滅菌綿棒を使用して頭蓋骨の表面を乾燥させます。
   3. 耳と口のバーを調整して、頭の位置を標準化します。
      注:ブレグマとラムダの垂直座標は、前後位置決めで同一である必要があります。
   針
   4. を前骨に置き、目的の注射ポイントの座標を計算します(このプロトコルで選択された対象の座標:前後(AP):+ 0.5 mm、内側外側(ML):+ 1.5 mm)。針をその点まで動かし、インクで印を付けます。
      注: 座標は、フランクリンとパクシノスのマウス ブレイン アトラスに基づいて選択されました。ブレグマからの距離はmmです。
   5. 滅菌された0.9%NaClを頭蓋骨に塗布し、外科用歯科用ドリルで頭蓋骨に直径2〜3 mmの穴を開けます。
   6. 針を硬膜の表面に移動し、深さ座標を計算します。
4. 移植手順
   1. ウイルス形質導入されたヒト神経前駆細胞をチューブに再懸濁し、2 μLの細胞懸濁液をシリンジ(5 μLまたは10 μL)に引き出します。
      注:細胞懸濁液に気泡が存在しないことを確認してください。細胞の沈降を避けるために、注射器は定位装置に取り付けられるまで水平位置に保つ必要があります。
   2. 注射器を標的部位(計算された座標:AP:+ 0.5 mm、ML:+ 1.5 mm)の上に置き、針を硬膜の表面にゆっくりと動かします。
      注:正しい座標が不明な場合は、細胞を移植する前に、色素による注射と注射部位の組織学的評価を行います。
   3. 針を 0.02 mm/s の速度で脳に適切な深さまで誘導します (このプロトコルで選択される座標は背腹側 (DV) - 0.8 mm です)。深さを0.1mmオーバーシュートし、同じ距離で針を引き抜いて、注入された細胞用のポケットを作成します。
   4. 細胞の漏れを防ぐために、鉗子を使用して針の周りに組織接着剤を塗布します。
   5. 調製した細胞懸濁液2 μLを3〜5 nL / s.
      の一定速度で注入します注:注入手順は7〜12分続きます。
   6. 注射後、針を少なくとも 5 分間所定の位置に置いてから、ゆっくりと抜きます。ティッシュ接着剤を塗布して頭蓋骨の穴を塞ぎ、さらに2分間待ちます。